DNA-replikasjon og DNA-reparasjon er blant cellens mest grunnleggende og sårbare prosesser. Hver eneste celledeling krever at hele genomet kopieres med presisjon, samtidig som DNA kontinuerlig utsettes for både spontane skader og ytre påvirkninger. Feil kan oppstå når som helst, under selve replikasjonen, ved kjemiske endringer i basene, eller når stråling og toksiner angriper DNA-strukturen.
For å overleve er cellen avhengig av et omfattende system av kontrollpunkter, korrekturfunksjoner og spesialiserte reparasjonsmekanismer som sammen opprettholder genomets integritet. Når disse mekanismene svikter, eller når skadene blir for mange, kan resultatet bli mutasjoner, cellestans eller celledød. Slik ligger grunnlaget både for evolusjon og for sykdommer som kreft.
Oversikt over replikasjon
DNA-replikasjon er en prosess som må gjennomføres før hver celledeling, og den skjer i S-fasen av cellesyklusen. Etter G1-fasen inneholder cellen ett sett kromosomer, men i løpet av S-fasen kopieres hele genomet slik at hver dattercelle senere kan få en fullstendig og identisk kopi. Når replikasjonen er fullført, har cellen gått fra et diploid genom med to kopier av hvert kromosom til et fordoblet genom der søsterkromatidene ligger tett sammentvunnet. Dette er et helt nødvendig forstadium til mitosen.
Replikasjonen er semikonservativ, noe som betyr at hver av de to nye DNA-dobbelttrådene består av én gammel og én nysyntetisert tråd. Prosessen er samtidig bidireksjonell: når et replikasjonsorigo aktiveres, åpner DNA-heliksen seg og replikasjonsmaskineriet etableres i to retninger slik at det dannes to replikasjonsgafler som beveger seg bort fra hverandre.
I humane celler finnes det titusenvis av replikasjonsorigi som ikke aktiveres samtidig, men i et koordinert mønster gjennom S-fasen. På denne måten unngår cellen å bruke opp dNTP-lageret sitt for raskt, og den oppnår en kontrollert progresjon gjennom genomet. Hvilke origi som tennes først varierer mellom celletype og kromatinmiljø, og rekkefølgen er strengt regulert.
Selve replikasjonen foregår i organiserte strukturer som kalles replikasjonsfabrikker. Her er flere replikasjonsgafler samlet i større proteinkomplekser som fungerer som arbeidsstasjoner. DNA-et trekkes inn og føres gjennom disse komplekse strukturene, mens polymerasene og alle hjelpeproteinene er fast organisert i rommet. Dette viser hvor sterkt kontrollert og romlig strukturert DNA-syntesen faktisk er.
Initiering av replikasjonen
Før DNA kan kopieres, må cellen først sørge for at bestemte steder på genomet klargjøres som startpunkter. Disse områdene kalles replikasjonsorigi, og de ligger spredt langs hele kromosomet. I løpet av G1-fasen markeres disse stedene gjennom en prosess som kalles «origin licensing». Et stort proteinkompleks, prereplikasjonskomplekset, samles da på hvert origo. Det består blant annet av ORC-proteiner som fungerer som et stillas, samt Cdc6, Cdt1 og helikaseringen MCM2–7. Når disse proteinene har bundet seg, er området lisensiert for replikasjon senere i S-fasen.
Selve syntesen starter først når cellen går inn i S-fasen. Spesifikke kinaser fosforylerer MCM-komplekset, og denne modifikasjonen aktiverer helikasefunksjonen slik at DNA-trådene kan åpnes. Dette skaper et åpent replikasjonskompleks som fungerer som et landingspunkt for de første enzymene i replikasjonsmaskineriet. Cdc45 og polymerase α/primase rekrutteres for å starte dannelsen av korte RNA–DNA-primere, som senere skal fungere som startpunkt for de store replikative polymerasene.
Når helikasen først er aktivert, finnes det en risiko for at den samme origin kan aktiveres på nytt i samme S-fase. For å forhindre dette produserer cellen proteinet Geminin, som binder til Cdt1 og blokkerer ny lisensiering før neste celledeling. Dette er en av de viktigste sikkerhetsmekanismene som sørger for at hvert kromosom kopieres nøyaktig én gang.
Initieringen fungerer dermed som en kontrollert overgang fra en lisensiert, men inaktiv strukturell tilstand i G1 til en aktiv og dynamisk replikasjonsgaffel i S-fasen. Når primerne er laget, og polymerasene er på plass, kan syntesen av nytt DNA begynne i begge retninger fra hvert origo, og replikasjonen går over i en fase der kontinuerlig og diskontinuerlig DNA-syntese må koordineres nøye på de to templattrådene.
Leading strand og lagging strand
Når replikasjonen er i gang, åpner helikasen de to DNA-trådene slik at de kan brukes som templat. De to trådene har motsatt orientering, og polymerasene kan bare bygge nytt DNA i 5’–3’-retning. Dette gjør at de to trådene syntetiseres på ulike måter.
På den ene templattråden kan polymerasen arbeide kontinuerlig i samme retning som replikasjonsgaffelen beveger seg. Denne kalles leading strand, og den forlenges jevnt fra en enkelt primer. Det skaper en stabil og effektiv syntese.
På den andre templattråden må polymerasen starte flere ganger. Her beveger replikasjonsgaffelen seg i motsatt retning av synteseriktningen, og polymerasen kan derfor bare lage korte DNA-stykker av gangen. Disse fragmentene kalles Okazaki-fragmenter og bygges ut fra nye primere som legges ned fortløpende. Etter hvert kobles fragmentene sammen til en sammenhengende tråd.
Begge trådene syntetiseres samtidig og holdes tett koordinert av replikasjonsmaskineriet. Selv om mekanismene er ulike, er målet det samme: å sikre at hver av de to nydannede DNA-dobbeltrådene blir fullstendige og nøyaktige kopier av templaten.
Primerdannelse og polymerasebytte
DNA-polymeraser er svært effektive enzymer, men de kan ikke starte fra ingenting. De trenger en allerede eksisterende 3’-ende å bygge videre på. Derfor må cellen først lage et lite startstykke, en primer, før replikasjonen kan komme i gang. Denne primeren lages av et samarbeid mellom to enzymer: primase og polymerase α.
Primase er spesialisert på å legge ned en kort RNA-sekvens direkte på enkelttrådet DNA. Denne biten er bare noen få nukleotider lang, men den fungerer som et ankerpunkt som polymerase α kan gripe tak i. Polymerase α forlenger primeren med en kort DNA-sekvens, slik at primeren nå består av både RNA og DNA. Dette fungerer som startpunktet som alt annet bygges videre på.
Når primeren er på plass, overtar de store og mer nøyaktige polymerasene. Polymerase ε arbeider på leading strand og kan jobbe jevnt og uten avbrudd. Polymerase δ tar seg av lagging strand, hvor syntesen må startes på nytt hele tiden. Begge polymerasene er avhengige av PCNA, et ringformet protein som omslutter DNA og holder polymerasen stabilt festet slik at den kan arbeide effektivt. Dette gir en høy prosessivitet, altså evnen til å lage lange DNA-stykker uten å falle av. Før PCNA kan gjøre jobben sin, må den lastes på DNA av RFC, et protein som midlertidig åpner ringen slik at DNA kan tres inn.
På lagging strand er situasjonen mer komplisert. Her dannes det en primer og et Okazaki-fragment for hver gang polymerasen må hoppe etter den bevegende replikasjonsgaffelen. Hver gang polymerase δ nærmer seg starten på et tidligere fragment, møter den primeren som ligger der. Den skyver primeren litt til side og danner en liten enkeltrådet flap. Denne flap’en må fjernes før fragmentene kan kobles sammen.
RPA binder først til flap’en og stabiliserer den. Deretter kommer endonukleaset Dna2 og klipper bort størsteparten av den, men Dna2 stopper når flap’en blir kortere enn det RPA kan gjenkjenne. Nå tar Fen1 over. Fen1 er spesialisert på å fjerne de siste nukleotidene av primeren, og når dette er gjort, ligger en ren og sammenhengende DNA-sekvens klar. Til slutt trer DNA-ligase 1 inn og lager den siste fosfodiesterbindingen som kobler fragmentene sammen til én kontinuerlig tråd.
Nøyaktighet og proofreading
Under DNA-replikasjonen settes det inn millioner av nukleotider i løpet av kort tid. Selv små feil kan få konsekvenser, og de replikative polymerasene er derfor utstyrt med egne korrekturmekanismer. Polymerase ε og polymerase δ har en innebygget 3’–5’ eksonukleaseaktivitet som kan fjerne feil baser straks de settes inn. Hvis en base ikke passer mot templaten, endres formen på DNA-dupleksen, og polymerasen stopper. Den nydannede enden flyttes da til eksonukleaseområdet, hvor den feilaktige nukleotiden fjernes. Deretter føres enden tilbake til polymerasesetet, og syntesen fortsetter.
Kombinasjonen av nøyaktig baseparing, proofreading og kontrollert replikasjonshastighet gjør feilraten svært lav. Etter alle mekanismer er summert, oppstår det i gjennomsnitt én feil per ti milliarder baser som syntetiseres. Likevel er dette nok til at mutasjoner gradvis oppstår i vev med høy delingsaktivitet.
Replikasjonsgaffelen, replikasjonsfabrikker og regulering av replikasjonshastighet
I eukaryote celler danner polymeraser, helikase, PCNA, RPA, ligase og flere andre proteiner en stabil replikasjonsgaffel som holdes samlet av et nettverk av interaksjoner. PCNA er et sentralt bindeledd i denne strukturen og kan rekruttere et stort antall proteiner som deltar i syntesen, i prosesseringen av Okazaki-fragmenter og i reparasjon når det oppstår problemer. Selv om modellen ofte fremstilles forenklet, viser forskning at gaffelen rommer et bemerkelsesverdig høyt nivå av regulering og koordinering.
Replikasjonen foregår i organiserte strukturer i kjernen som kalles replikasjonsfabrikker. Disse dannes tidlig i S-fasen og utgjør områder der store proteinkomplekser samler polymeraser, helikase, PCNA og andre sentrale komponenter. Fabrikkene ligger relativt fast i rommet, og DNA-tråden beveger seg gjennom dem mens syntesen pågår. Hver fabrikk rommer flere aktive replikasjonsgafler, noe som gir en høy lokal konsentrasjon av replikasjonsaktivitet. Mikroskopiske markører som PCNA koblet til fluorescerende proteiner viser at dette er tydelige soner med tett koordinert DNA-syntese. I tillegg finnes mange av enzymene som håndterer skader og regulerer gaffelprogresjon i nærheten av fabrikkene, slik at cellen raskt kan reagere når replikasjonen møter problemer.
Hastigheten gaffelen beveger seg med, er nøye kontrollert. Hvis syntesen går for raskt eller for sakte, tolker cellen dette som et tegn på replikasjonsstress. Da aktiveres et omfattende nettverk av signalmolekyler, samlet under betegnelsen DNA Damage Response. Dette systemet kan stanse cellesyklusen, mobilisere reparasjonsproteiner eller, hvis skaden blir for alvorlig, føre cellen inn i senescens eller apoptose.
Mange faktorer påvirker replikasjonshastigheten, blant annet tilgangen på nukleotider, kvaliteten på Okazaki-fragmentprosessen, aktiviteten ved replikasjonsorigi og ulike medikamenter som brukes i kreftbehandling. Når denne balansen forstyrres, øker risikoen for mutasjoner.
Translesjonssyntese (TLS)
Når replikasjonsgaffelen møter en skade i DNA, stanser de vanlige replikative polymerasene fordi de ikke klarer å lese templaten gjennom en base som er endret, sammenkoblet eller fysisk hindret. Hvis gaffelen skulle forbli stoppet for lenge, ville DNA-trådene åpnes mer enn de tåler, og cellen ville være i fare for å akkumulere skader som ikke lar seg reparere. For å komme videre i slike situasjoner bruker cellen translesjonssyntese, et system der spesialiserte polymeraser midlertidig overtar syntesen.
TLS-polymeraser er bygget for å kopiere DNA som avviker fra normal struktur. De har større og mer åpne aktive seter, noe som gir plass til forvrengte baser og voluminøse skader. Denne fleksibiliteten gjør dem godt egnet til å komme forbi hindringer, men det gir også en lavere spesifisitet for riktig baseparing. De gjør derfor flere feil enn polymerase ε og δ, og de mangler ofte proofreading-aktivitet. Resultatet er en syntese som kan fullføre kopieringen gjennom et skadet område, men samtidig øker risikoen for mutasjoner.
Et av de tydeligste eksemplene på en TLS-polymerase med en viktig biologisk rolle er polymerase η (eta). UV-stråling kan danne såkalte CPD-dimerer mellom to nabobaser, ofte to tyminer. Disse dimerene bøyer og forvrenger DNA-dupleksen og skaper en blokk for de vanlige polymerasene. Polymerase η har et aktivt sete som rommer hele dimeren, og den klarer å lese templaten slik at den setter inn to riktige adeniner på motsatt side av skaden. På denne måten bidrar den til en “feiltolerant” syntese som faktisk bevarer den opprinnelige sekvensen gjennom et skadet område. Mennesker som mangler polymerase η, utvikler varianten XP-V av Xeroderma pigmentosum. De har normal nukleotide-eksisjonsreparasjon, et system som klipper ut og erstatter UV-skadde nukleotider, men klarer ikke å kopiere gjennom UV-skader på en korrekt måte, slik at de får mutasjoner hver gang de eksponeres for sollys.
Andre TLS-polymeraser håndterer andre typer DNA-skader, som oksiderte baser, altså baser som er kjemisk endret av reaktive oksygenforbindelser, «bulky» addukter der store molekyler har festet seg til DNA og forandret formen på heliksen, eller interstrand crosslinks, der de to DNA-trådene blir kjemisk bundet sammen og hindrer normal åpning av dobbelheliksen. Polymerase κ og ι har egne spesialiseringer, mens polymerase ζ og REV1 ofte fullfører forlengelsen etter at en annen TLS-polymerase har satt inn den første basen over skaden. Samlet utgjør de et fleksibelt system som kan tilpasses mange typer hindringer.
TLS aktiveres vanligvis gjennom modifikasjon av PCNA. Når PCNA ubiquitineres, endres rekrutteringen av polymeraser, og en TLS-polymerase kan ta over for hovedpolymerasen i et begrenset område. Etter at skaden er passert, fjernes modifikasjonene, og polymerase ε eller δ gjenopptar syntesen.
Translesjonssyntese er derfor en nødvendig del av replikasjonen i et levende genom. Den gjør det mulig for cellen å fullføre DNA-kopieringen til tross for skader som ikke kan repareres før gaffelen når dem. Samtidig representerer TLS en kilde til nye mutasjoner, siden fleksibiliteten i aktive seter og mangelen på korrektur gjør polymerasene mindre presise. Denne risikoen er en del av balansen mellom å bevare nøyaktighet og å sikre at replikasjonen ikke stopper opp på en måte som truer cellens overlevelse.
DNA skader, reparasjon og mutasjoner
DNA-skader
DNA utsettes for et stort antall kjemiske endringer hver eneste dag. Mange av dem oppstår helt spontant når baser mister grupper, endres kjemisk eller reagerer med vann og oksygenholdige forbindelser i cellen. Andre skader kommer utenfra, som når UV-lys danner bindinger mellom nabobaser, eller når ioniserende stråling skader både baser og sukker-fosfat-ryggraden. Kjemiske forbindelser i miljøet og i maten vi spiser kan også feste seg til DNA eller endre basenes struktur.
De fleste skadene oppdages og håndteres før de rekker å gi varige konsekvenser. Cellen har et stort repertoar av reparasjonsmekanismer som fjerner, erstatter eller omgår skader for å bevare stabiliteten i genomet. Samtidig oppstår det nye skader kontinuerlig, og reparasjonssystemene må arbeide gjennom hele cellens levetid for å hindre at mutasjoner samler seg opp. Dersom en skade ikke repareres, eller reparasjonen skjer på en unøyaktig måte, kan resultatet bli endringer i DNA-sekvensen som videreføres til nye celler.
Oversikt over typer DNA-skader
DNA kan påvirkes av mange typer endringer. Noen oppstår når basene endrer kjemisk struktur, andre når dobbelheliksen deformeres, og noen når selve sekvensen forskyves eller mister informasjon. Nedenfor følger en samlet oversikt.
Enkelttrådbrudd (SSB) er små avbrudd i én av DNA-trådene, ofte forårsaket av reaktive oksygenforbindelser. Cellen kan som regel reparere disse effektivt fordi den andre tråden gir riktig mal for syntesen.
Dobbelttrådbrudd (DSB) innebærer brudd i begge tråder samtidig og er blant de mest alvorlige skadene. Disse oppstår ved ioniserende stråling eller når en replikasjonsgaffel stopper på en måte som får hele strukturen til å kollapse.
AP-seter oppstår når en base mister kontakten med sukkeret og faller av. Slike tomme posisjoner fører lett til feil basematching hvis de kopieres før reparasjon.
Kjemisk endrede baser, som ved deaminering og oksidering, skaper baser som ikke lenger har riktige hydrogenbindingsmønstre. Eksempler er uracil fra cytosin og 8-oxo-G fra oksidativt stress. Disse fører til mutasjoner ved neste replikasjon hvis de ikke fjernes.
Pyrimidindimerer dannet av UV-lys gjør at to nabotiminer kobles sammen. Dette stiver av DNA og blokkerer både polymeraser og transkripsjonsmaskineriet.
Bulky addukter er store kjemiske grupper som bindes kovalent til basene. De forstyrrer spiralen og gjør DNA vanskelig å lese.
Kryssbindinger kan dannes både innenfor samme tråd (intrastrand crosslinks) og mellom to tråder (interstrand crosslinks). De sistnevnte låser trådene sammen og hindrer at de separeres under replikasjon. Protein–DNA-kryssbindinger oppstår når proteiner bindes kovalent til DNA. Dette skaper massive hindringer for både replikasjon og transkripsjon.
Innsetting eller tap av nukleotider skjer når polymerasen glipper og setter inn for mange eller for få nukleotider. Dette kan gi rammeskift og strukturelle mutasjoner, og det ses ofte i repeterte sekvenser.
Delesjoner og duplikasjoner er større sekvensendringer som oppstår når DNA glir ut av register under replikasjon. Polymerasen kan hoppe over et område eller kopiere det to ganger, noe som endrer lengden på sekvensen.
Mikrosatellittinstabilitet oppstår i korte repeterte sekvenser, der polymerasen lett danner små løkker. Disse løkkene gir insersjoner eller delesjoner i repeat-lengden. Tilstanden blir særlig uttalt når mismatch-reparasjon ikke fungerer, og er et karakteristisk trekk ved visse kreftformer som Lynch syndrom.
Endogene skader (spontane skader)
En stor del av all DNA-skade oppstår helt spontant i cellen, uten påvirkning fra ytre faktorer. Disse skadene kommer som et resultat av vanlige kjemiske reaksjoner som skjer i et levende miljø, der vann, oksygen og metabolsk aktivitet hele tiden påvirker basene og sukker-fosfat-ryggraden. Selv i friske celler under normale forhold oppstår det titusener av slike skader hver dag, og nesten alle blir reparert før de får varige konsekvenser.
En av de vanligste skadeformene er depurinering, der bindingen mellom en purinbase (adenin eller guanin) og sukkeret i DNA brytes. Basen faller av, og det står igjen en posisjon uten base, en såkalt AP-site. Denne reaksjonen skjer spontant ved kroppstemperatur og skaper et stort antall slike tomme posisjoner i løpet av et døgn. Selv om hver enkelt skade er liten, kan en AP-site føre til feil innsetting av nukleotider ved neste replikasjon dersom den ikke repareres.
En annen hyppig skade er deaminering, der en aminogruppe fjernes fra basen. Når cytosin deamineres, omdannes det til uracil, en base som vanligvis ikke forekommer i DNA. Denne endringen gjør at uracil vil pares med adenin i stedet for med guanin, og dette skaper en mutasjon hvis det ikke rettes opp.
Når 5-metylcytosin deamineres, dannes tymin, og dette er spesielt problematisk fordi T oppfattes som en normal base. Slike C→T-overganger er blant de vanligste mutasjonstypene i det humane genomet.
Celler produserer også reaktive oksygenforbindelser (ROS) som et biprodukt av vanlig metabolisme. Disse kan reagere med DNA og skape oksidative baseskader, som for eksempel 8-oxo-guaninn. Denne basen kan feilpare med adenin, og slik skapes en G→T-mutasjon hvis skaden kopieres videre. Oksidative skader kan også ramme sukkeret i DNA og føre til enkelttrådbrudd.
Det finnes situasjoner der cellen bevisst lager DNA-skader for å oppnå en biologisk fordel. Dette skjer særlig i immunforsvarets B-celler, som skal produsere antistoffer. For at antistoffene skal kunne gjenkjenne et nesten uendelig antall fremmede molekyler, må B-cellene kunne variere genene sine langt mer enn det vanlige mutasjonsrater tillater. Cellen har derfor utviklet et enzym, AID (Activation-Induced Deaminase), som gjør akkurat dette mulig.
AID virker ved å deaminere cytosin, som betyr at enzymet fjerner en aminogruppe og dermed gjør cytosin om til uracil, en base som egentlig ikke hører hjemme i DNA. Denne lille kjemiske endringen settes i gang med vilje fordi den tvinger reparasjonssystemene til å jobbe på området. Når reparasjonsmaskineriet prøver å rette opp uracilen, oppstår det mange mulige løsninger, og noen av dem fører til små mutasjoner. Samlet skaper dette en kontrollert mutasjonsprosess som øker variasjonen i antistoffgenene. Det er slik kroppen klarer å forbedre antistoffer gjennom somatisk hypermutasjon og omorganisere dem gjennom class switch recombination, slik at de får nye funksjoner.
Selv om dette systemet er nyttig, er det også risikabelt. Cellen må sørge for at AID kun virker på de riktige områdene i genomet. AID aktiveres derfor bare i bestemte B-celler, på bestemte tidspunkt, og i avgrensede deler av DNA. Hvis AID begynner å deaminere cytosiner utenfor disse områdene – for eksempel i gener som styrer celledeling eller vekst – kan reparasjonsforsøkene skape mutasjoner som i verste fall leder til kreft. Slik feilregulert AID-aktivitet er kjent som en av mekanismene bak enkelte lymfomer.
En beslektet gruppe enzymer, APOBEC-familien, kan også deaminere cytosiner. Disse enzymene har viktige funksjoner i antiviral forsvar, men kan også feilaktig virke på cellens eget DNA. Når APOBEC setter inn mange slike deamineringer etter hverandre, skaper de karakteristiske mutasjonssignaturer som man ofte ser i ulike krefttyper. I motsetning til AID, som er strengt regulert og skal virke i et kontrollert miljø, kan APOBEC komme på banen når cellen står under stress. Da kan de bidra til en bred, ukontrollert spredning av mutasjoner.
En viktig grunn til at endogene skader kan være særlig problematiske, er at enkelttrådet DNA (ssDNA) er mye mer reaktivt enn dobbelttrådet DNA. Når DNA replikeres, eller når replikasjonen går saktere enn normalt, blir større områder av genomet eksponert som ssDNA. I denne formen er basene ikke beskyttet av baseparing, og både deaminering og oksidative reaksjoner skjer langt raskere. Dette gjør replikasjonsstress til en tilstand som akselererer opphopning av endogene skader.
Eksogene DNA-skader
DNA skades kontinuerlig av faktorer som kommer utenfra cellen. Disse eksogene skadene kan være både kjemiske og fysiske, og mange av dem endrer DNA på måter som er mer omfattende og strukturelt ødeleggende enn de spontane skadene som oppstår inne i cellen. De er viktige i utviklingen av kreft, men også i virkningen av flere cellegifter som bevisst skader DNA i kreftceller for å hindre dem i å dele seg.
Fysiske skadefaktorer
Ioniserende stråling (IR)
Ioniserende stråling omfatter blant annet røntgenstråler, gammastråling og radioaktive partikler som alfa- og betastråling. Felles for dem er at de har nok energi til å slå elektroner løs fra atomer i vevet. Når dette skjer, settes det i gang kjemiske reaksjoner som kan forandre basene i DNA og svekke strukturen i dobbelheliksen.
Strålingen kan treffe DNA direkte, men mye av skaden oppstår indirekte fordi vannmolekyler ioniseres og brytes opp. Dette kalles vannradiolyse, og det fører til dannelse av reaktive oksygenforbindelser som hydroksylradikaler (•OH), superoksid (O₂•⁻) og hydrogenperoksid (H₂O₂).
Hydroksylradikalet reagerer umiddelbart med det første molekylet det treffer, og DNA er et lett mål når cellen bestråles.
De reaktive forbindelsene som dannes på denne måten angriper både basene og sukker-fosfat-ryggraden i DNA.
Basene kan oksideres, sukkeret kan bli kjemisk ustabilt, og ryggraden kan brytes slik at det oppstår enkelt- eller dobbelttrådbrudd. Ioniserende stråling lager ofte det som kalles komplekse skader, der flere ulike lesjoner ligger tett samlet. Cellen må reparere hvert enkelt brudd og hver modifiserte base separat, og dette øker sannsynligheten for feil. Dobbelttrådbrudd er særlig utfordrende, både fordi de er farlige i seg selv og fordi de som regel oppstår sammen med andre skader som gjør reparasjonen ekstra krevende.
Mitokondriene spiller også en viktig rolle i skadeprosessen. De produserer ROS kontinuerlig under normal metabolisme, og når celler utsettes for ioniserende stråling, øker denne produksjonen ytterligere. Dette skaper en andre bølge av ROS som kommer etter den umiddelbare skaden fra selve strålingen. Denne bølgen kan påvirke DNA, proteiner og membraner lenge etter bestrålingen og bidrar til at skadeutviklingen fortsetter over tid.
Celler har en rekke enzymatiske systemer som forsøker å kontrollere ROS før de gjør skade.
Superoksid dismutase (SOD) omdanner superoksid til hydrogenperoksid, som deretter brytes ned av katalase eller peroksidaser.
Glutation-systemet hjelper også med å redusere peroksider og opprettholde redoksbalansen. Disse systemene er effektive, men ved ioniserende stråling dannes ROS så raskt og i så stor mengde at beskyttelsen ofte ikke er tilstrekkelig til å forhindre DNA-skade.
UV-stråling
UV-stråling påvirker DNA hovedsakelig ved at basene absorberer energien i lyset.
Pyrimidinbasene, særlig tymin, er spesielt utsatt. Når UVB treffer DNA, kobles to nabotyminer sammen og danner pyrimidindimerer.
Den vanligste varianten er CPD-dimerer (cyclobutane pyrimidine dimers), mens 6–4-fotoprodukter er en annen type skade som lager en kraftigere bøyning i DNA-strukturen. Disse bindingene gjør at dobbelheliksen blir stiv og vanskelig å åpne, og både replikasjon og transkripsjon stopper opp når maskineriet møter slike strukturer.
UVB er den delen av UV-spektrumet som gir størst direkte DNA-skade, men UVA spiller også en rolle gjennom dannelse av oksidative skader. UVA har lavere energi enn UVB og lager færre dimerer, men trenger dypere ned i hudlaget og reagerer med oksygenholdige molekyler slik at det dannes reaktive oksygenforbindelser som igjen angriper DNA. Dette gir baseskader som ligner dem som oppstår ved oksidativt stress inne i cellen.
UVA og UVB opptrer ofte sammen i naturlig sollys, og summen av direkte og indirekte skader gir en belastning som cellene må håndtere hver eneste gang huden eksponeres. I celler som skal dele seg, blir UV-skader ekstra kritiske. En enkelt dimer er nok til å stoppe replikasjonsgaffelen. Hvis skaden ikke repareres før repliseringen, må cellen bruke en translesjonspolymerase for å komme forbi hindringen, og dette øker risikoen for mutasjoner. Det er slik gjentatt UV-eksponering over tid kan skape stabile genetiske endringer som danner grunnlag for hudkreft.
Celler i huden er derfor avhengige av gode reparasjonssystemer for å fjerne både dimerer og oksidative skader etter UV-lys. Nukleotide-eksisjonsreparasjon (NER) er den viktigste mekanismen for å fjerne dimerer, og evnen til å reparere disse skadene raskt er avgjørende for å bevare normal funksjon. Hvis NER ikke fungerer, akkumuleres UV-skader etter eksponering, og risikoen for mutasjoner øker dramatisk. En illustrasjon på dette er personer med defekter i NER, der selv små mengder UV-lys gir store mengder DNA-skade som cellen ikke klarer å fjerne.
Kjemiske skadefaktorer
Oksiderende agens
Oksiderende agens er kjemiske forbindelser som bidrar til oksidativt stress i cellen. De virker ved å trekke elektroner fra molekyler de møter, og DNA-baser er særlig utsatt. Slike forbindelser finnes i røyking, luftforurensning, inflammasjon og enkelte industrikjemikalier, og de kan også dannes som et resultat av normal cellulær aktivitet. Når disse stoffene reagerer med DNA, endres den kjemiske strukturen i basene, og dette gir opphav til mutasjoner dersom skaden ikke fjernes i tide.
En vanlig oksidativ DNA-skade er 8-oxo-guanin, som oppstår når guanin oksideres. Denne basen kan pares med adenin i stedet for cytosin og skaper en G→T-mutasjon hvis den kopieres videre. Det finnes mange varianter av oksidative baseskader, og flere av dem påvirker hvordan polymerasen leser templaten. Oksidasjon kan også ramme sukkeret i DNA, noe som svekker bindingene i ryggraden og kan lede til brudd.
Celler har en rekke enzymer som begrenser oksidativ skade, blant annet systemer som håndterer hydrogenperoksid og organiske peroksider, og et stort glutation-system som holder cellens redokstilstand stabil. Disse mekanismene reduserer mengden oksidative skader i DNA, men de kan ikke forhindre dem helt, spesielt i celler som står i et miljø med mye røyking, inflammasjon eller kjemiske irritanter.
Alkylerende forbindelser
Alkylerende forbindelser er kjemiske stoffer som festes til DNA ved å overføre en alkylgruppe til en base. Denne lille kjemiske endringen kan få store konsekvenser for baseparing, fordi den endrer formen og ladningsfordelingen i basen. Alkylering kan komme fra tobakk, mat som inneholder nitrosaminer, industrielt utslipp og enkelte miljøgifter, men den brukes også målrettet i cellegiftbehandling. Når en base blir alkyleret, kan den miste evnen til å binde riktig partner, og polymerasen kan sette inn feil nukleotid ved neste replikasjon.
Et klinisk viktig eksempel er dannelsen av O⁶-metylguanin, en skade som oppstår når en metylgruppe festes til guanin. Denne basen ligner ikke lenger normal guanin og kan pares med tymin. Hvis skaden ikke fjernes av reparasjonsenzymet MGMT, føres den videre i replikasjonen og ender i en stabil G→A-overgang i dattertråden. Alkylering kan også skje på andre steder i basen eller på sukkeret, og slike reaksjoner kan gjøre DNA-strukturen ustabil eller føre til brudd i ryggraden.
Flere cellegifter virker ved å alkylere DNA målrettet for å hindre kreftceller i å dele seg. Temozolomid er et kjent eksempel og brukes blant annet ved glioblastom. Disse medikamentene skaper mange skader på kort tid, og reparasjonssystemene blir overbelastet. Når cellen ikke klarer å håndtere skadene, stanser delingen og cellen dør. Det samme prinsippet utnyttes av andre alkylerende midler, men effekten varierer med hvor aktive reparasjonssystemene er i cellen.
Kryssbindere
Kryssbindere er kjemiske forbindelser som danner kovalente bindinger mellom baser i DNA. De kan enten binde to baser på samme tråd eller koble de to trådene i dobbelheliksen sammen. Hvis to nabobaser på samme DNA-tråd bindes til hverandre, kalles det en intrastrand crosslink. Denne typen binding lager en lokal forstyrrelse i spiralen og gjør det vanskelig for polymerasen å lese området, men strukturen kan fremdeles åpnes. Mer krevende er interstrand crosslinks, der en base på den ene tråden bindes til en base på den andre tråden. Dette låser dobbelheliksen i lukket form og hindrer både replikasjon og transkripsjon fordi trådene ikke lenger kan separeres. For at cellen skal rydde opp i slike skader, må den kombinere flere reparasjonssystemer, blant annet nukleotide-eksisjonsreparasjon, homolog rekombinering og spesialiserte mekanismer som er utviklet for nettopp denne typen skade.
Et klinisk viktig eksempel på en kryssbinder er cisplatin, som reagerer med guaninbaser i DNA. Cisplatin lager hovedsakelig intrastrand crosslinks mellom to guaniner (GpG) eller mellom guanin og adenin (ApG). Disse skadene bøyer og stiver av DNA-heliksen og gjør det krevende for replikasjonsmaskineriet å passere. Cisplatin brukes nettopp fordi kreftceller har høy delingsaktivitet og derfor er ekstra følsomme for skader som blokkerer replikasjonen. Andre kjemiske forbindelser, som nitrogenmustard-derivater, kan lage både intra- og interstrand crosslinks og er derfor enda mer omfattende i sin virkning på DNA-strukturen.
Kryssbindinger er blant de mest krevende skadene cellen kan møte. De påvirker ikke bare den lokale strukturen, men hindrer de mest grunnleggende prosessene som krever at trådene skilles fra hverandre. Når slike skader oppstår i større mengder, enten gjennom cellegift eller gjennom eksponering for kjemiske forbindelser i miljøet, må cellen sette i gang omfattende reparasjon for å unngå genomisk ustabilitet eller celledød.
Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH)
Stoffer som finnes i sigarettrøyk, eksos og brent mat omdannes av kroppens CYP450-system til reaktive mellomprodukter. Disse metabolittene binder seg til DNA og danner bulky addukter som:
- presser basene ut av sin normale posisjon
- blokkerer polymeraser
- fremmer mutasjoner dersom de ikke fjernes av NER
Benzo[a]pyren er et kjent eksempel, og skadene det lager er sterkt knyttet til lungekreft.
Polysykliske aromatiske hydrokarboner er store, flate molekyler som dannes ved ufullstendig forbrenning av organisk materiale. De finnes blant annet i sigarettrøyk, eksos, brent eller sterkt grillede matvarer og i enkelte industrielle miljøer. I sin opprinnelige form reagerer de ikke direkte med DNA, men når de tas opp i kroppen, blir de omdannet av CYP450-enzymene i leveren og andre vev. Denne metabolske aktiveringen gjør PAH-ene mer reaktive, og noen av mellomproduktene binder seg lett til basene i DNA. Når et slikt molekyl kobles kovalent til en base, dannes det en bulky addukt – en skade som endrer formen på dobbelheliksen og gjør området vanskelig for polymerasen å lese.
En av de mest studerte forbindelsene i denne gruppen er benzo[a]pyren, et molekyl som finnes i høye konsentrasjoner i sigarettrøyk. Når benzo[a]pyren aktiveres i kroppen, dannes det et reaktivt epoksid som binder seg særlig til guanin. Denne bindingen dytter basen ut av sin normale posisjon og skaper en markert strukturell forstyrrelse. Hvis ikke denne skaden fjernes gjennom nukleotide-eksisjonsreparasjon, kan polymerasen sette inn feil nukleotid når DNA kopieres, noe som øker risikoen for mutasjoner. Slike mutasjoner sees hyppig i gener som regulerer cellevekst i lungevev, og dette er en av årsakene til at røyking er så sterkt forbundet med lungekreft.
PAH-skader er krevende for cellen fordi de ikke bare endrer selve basen, men hele strukturen rundt basen. DNA må åpnes og stabiliseres for at reparasjonsmaskineriet skal klare å fjerne adduktet, og dette er en prosess som krever energi og presis koordinering. Celler som stadig utsettes for PAH, som epitelcellene i luftveiene hos røykere, får derfor en høy belastning av denne typen DNA-skade. Hvis reparasjonssystemene ikke klarer å holde tritt med skadene, begynner mutasjoner å hope seg opp over tid. Dette bidrar til at PAH er en av de mest veldokumenterte klasser av karsinogener hos mennesker.
DNA reparasjon
Celler har utviklet et bredt repertoar av mekanismer som oppdager og reparerer DNA-skader. Hver mekanisme er spesialisert for en bestemt type skade, men de overlapper ofte og samarbeider når skaden er omfattende. De fleste reparasjonsprosessene starter med at proteiner kjenner igjen at DNA-strukturen er forstyrret. Dette kan være en base som har feil form, en sukkergruppe som er skadet, en uvanlig bøyning i dobbelheliksen eller et brudd i sukker-fosfat-ryggraden. Når slike avvik registreres, rekrutteres reparasjonsfaktorer som enten fjerner skaden eller omgår den for å holde replikasjonen i gang.
En viktig kategori er mekanismer som retter opp skader på enkeltbaser. Base-eksisjonsreparasjon (BER) håndterer små, kjemisk endrede baser som ved deaminering eller oksidasjon. I denne prosessen fjernes den skadede basen av et glykosylaseenzym, og det lages et lite brudd i DNA som tettes igjen etter at riktig base er satt inn. En annen mekanisme som fjerner baser, men i større skala, er nukleotide-eksisjonsreparasjon (NER). Denne veien brukes når skaden er større og vrir hele DNA-strukturen, slik som ved pyrimidindimerer eller bulky addukter. Her kuttes en lengre DNA-bit ut, og polymerasen fyller inn et nytt stykke ved hjelp av den uskadede tråden som mal.
Feil som oppstår under replikasjon, håndteres av mismatch-reparasjon (MMR). Denne mekanismen identifiserer nylig kopierte områder og retter opp feil baseparinger og små løkker som har oppstått i repeterte sekvenser. Når MMR ikke fungerer, blir slike feil stående, noe som kan føre til mikrosatellittinstabilitet og en økning i mutasjonsraten.
Brudd i DNA krever egne systemer. Enkelttrådbrudd kan luktes av ligaser når den andre tråden er intakt. Dobbelttrådbrudd er mer krevende og håndteres av mekanismer som enten søker etter en identisk kopi for nøyaktig reparasjon, eller som kobler endene sammen etter å ha renset dem. Når cellen bruker homolog rekombinering, finner den søsterkromatidet og bruker det som mal for å gjenopprette sekvensen uten tap av informasjon. Dette skjer oftest i S- og G2-fase, når en kopi finnes tilgjengelig. Alternativt kan cellen bruke non-homologous end-joining, som kobler endene sammen uten en mal. Denne prosessen er rask, men den kan føre til små tap eller innsettinger av nukleotider.
I situasjoner der DNA-skaden blokkerer replikasjonen og polymerasen ikke kommer videre, finnes det mekanismer som tillater cellen å omgå skaden midlertidig. Translesjonssyntese (TLS) er en slik løsning. Her tar en spesialisert polymerase over og setter inn nukleotider forbi skaden, selv om det ikke alltid skjer med full nøyaktighet. Dette gjør at replikasjonen kan fullføres, mens selve skaden kan repareres senere.
Direkte reparasjon
Direkte reparasjon er den mest effektive formen for DNA-reparasjon fordi skaden fjernes uten at DNA-tråden må kuttes eller syntetiseres på nytt. I stedet gjenopprettes den kjemiske strukturen i den skadde basen der og da. En av de best kjente mekanismene for direkte reparasjon er reaksjonen som utføres av enzymet MGMT (O⁶-metylguanin-DNA-metyltransferase). Dette enzymet kjenner igjen skaden O⁶-metylguanin, som oppstår når en metylgruppe har festet seg på guanin og endret baseparingsmønsteret. MGMT overfører metylgruppen fra DNA til seg selv, og i samme øyeblikk gjenopprettes guanin til sin normale form. MGMT blir inaktivert når den har tatt opp metylgruppen, noe som gjør denne reparasjonen til en “én-gangs-reparasjon” per enzymmolekyl. Likevel er den helt avgjørende for å hindre G→A-mutasjoner i celler som utsettes for alkylerende påvirkning.
En annen form for direkte reparasjon finnes i enzymer som fjerner oksiderte metylgrupper fra baser ved hjelp av oksygen og jern. Disse enzymene tilhører AlkB-familien og finnes også hos mennesker. De reverserer bestemte typer alkylskader ved å oksidere den uønskede gruppen slik at den løsner og basen får tilbake sin normale struktur. Disse reaksjonene skjer uten at basen fjernes fra DNA, og uten at det oppstår brudd i ryggraden, noe som gjør prosessen både presis og lite belastende for genomet.
Direkte reparasjon omfatter også mekanismer som håndterer små skader på sukker-fosfat-ryggraden. Enzymene som utfører dette, kan lukke enkelte typer avbrudd uten å involvere de mer omfattende reparasjonsveiene. Denne typen reparasjon er viktig fordi den hindrer at små avbrudd utvikler seg til større og mer komplekse skader.
Felles for alle formene for direkte reparasjon er at cellen bruker energien på å gjenopprette den skadde basen i stedet for å fjerne og erstatte den. Det gjør prosessen rask og nøyaktig. Selv om direkte reparasjon bare kan håndtere et begrenset sett av skadetyper, er den svært viktig for å forhindre mutasjoner i celler som utsettes for alkylerende og oksiderende påvirkning. Når disse mekanismene ikke fungerer, øker mutasjonsbelastningen betydelig, og andre reparasjonssystemer må ta over der direkte reparasjon kunne ha stoppet mutasjonen allerede ved kilden.
Base-eksisjonsreparasjon (BER)
Base-eksisjonsreparasjon håndterer de mange små skadene som endrer én base uten å forstyrre strukturen i hele DNA-heliksen. Dette gjelder skader som deaminering, oksidative baseskader og alkylskader, og disse oppstår i et så stort antall at cellen trenger en effektiv og presis mekanisme for å fjerne dem før de blir til mutasjoner. Den første oppgaven i denne prosessen utføres av en gruppe enzymer som kalles DNA-glykosylaser. Hvert glykosylase gjenkjenner en bestemt type endret base og fjerner akkurat denne ved å klippe av bindingen mellom basen og sukkeret i DNA. Basen løsner, og det står igjen et tomt punkt i DNA-tråden, en såkalt AP-site.
Når AP-sitet er dannet, tar neste trinn i reparasjonen over. Enzymet AP-endonuklease lager et lite brudd i DNA-ryggraden slik at området kan bearbeides mer presist. Cellen har to hovedmåter å håndtere dette bruddet på. Ved kortpatch-reparasjon fjernes ett enkelt nukleotid, og polymerasen setter inn en korrekt base. Deretter forsegler ligase tråden. Ved langpatch-reparasjon fjernes flere nukleotider, og polymerasen fortrenger en liten DNA-flik som senere klippes bort før ligase lukker området. Valget mellom kort og lang reparasjon avhenger blant annet av hvilken skade som fjernes og hvilke proteiner som er tilgjengelige i øyeblikket.
BER er spesielt viktig i celler som stadig utsettes for oksidativt stress. Skader som 8-oxo-guaninn produseres i stort antall, og hvis de ikke fjernes raskt, kan de føre til G→T-mutasjoner. BER spiller også en rolle i epigenetisk regulering. Når cellen ønsker å fjerne en metylert cytosin som en del av DNA-demetylering, brukes nettopp denne reparasjonsveien til å erstatte basen med en umetyleret variant. På den måten fungerer BER både som et system for vedlikehold av genomet og som en mekanisme for dynamisk regulering av genaktivitet.
Denne fleksibiliteten gjør BER til en av de mest sentrale reparasjonsveiene i cellen. Den håndterer et stort spekter av små, men hyppige skader som ellers ville ha samlet seg opp og bidratt til mutasjoner og genomisk ustabilitet. Når BER fungerer godt, fjernes skadene før de rekker å forstyrre replikasjonen. Når den svikter, øker mutasjonsraten, og cellen blir mer sårbar for både aldring og sykdom.
Nukleotide-eksisjonsreparasjon (NER)
Nukleotide-eksisjonsreparasjon er cellens viktigste mekanisme for å fjerne skader som gjør DNA vanskelig å lese, enten fordi basene er koblet sammen eller fordi et stort molekyl har festet seg til heliksen. Slike skader endrer formen på DNA og skaper en lokal bøyning som gjør det tydelig for reparasjonssystemene at strukturen ikke er intakt. NER fungerer ved å gjenkjenne disse deformasjonene, åpne området rundt skaden og fjerne et helt segment av DNA-strengen slik at polymerasen kan fylle inn en ny og uskadet sekvens.
Prosessen starter når proteinene som overvåker DNA-strukturen oppdager at heliksen er vridd eller forstyrret. I global genom-reparasjon, som arbeider over hele genomet, er XPC-komplekset sentralt i denne første gjenkjennelsen. Når skaden oppstår på en tråd som brukes til transkripsjon, aktiveres transkripsjonskoblet reparasjon. Her er det stoppet i RNA-polymerasen som fungerer som signal, og andre proteiner, blant dem CSA og CSB, rekrutteres for å løse polymerasen fra tråden og starte reparasjonen. I begge tilfeller kommer helikasekomplekset TFIIH til stedet. Dette komplekset har to ATP-drevne helikaser som åpner DNA rundt skaden slik at den blir tilgjengelig for videre prosessering.
Når området er åpnet, trer et sett av spesialiserte endonukleaser inn. XPF-ERCC1 kutter DNA på den ene siden av skaden, mens XPG kutter på den andre. Sammen fjerner de et segment på omtrent 25–30 nukleotider der skaden befinner seg. Dette skaper en liten åpning som polymerasen raskt fyller ut ved hjelp av templaten på den uskadede tråden. Deretter tettes tråden av ligase, og dobbelheliksen gjenoppretter sin normale struktur.
NER er helt nødvendig for å fjerne skader som pyrimidindimerer, 6–4-fotoprodukter og bulky addukter. Uten denne mekanismen ville UV-skader og mange miljøgifter raskt ført til alvorlige forstyrrelser i genomet. Betydningen av NER blir tydelig i sykdommer der denne reparasjonsveien ikke fungerer. Personer med Xeroderma pigmentosum har mutasjoner i ulike NER-gener og mangler derfor evnen til å fjerne UV-induserte skader. Selv små mengder sollys gir store mengder DNA-skade som ikke blir reparert, og de utvikler ofte hudkreft i ung alder. Andre sykdommer, som Cockayne syndrom, skyldes feil i transkripsjonskoblet NER og fører til alvorlige utviklingsforstyrrelser fordi celler som prøver å lese gener med skader ikke klarer å fullføre transkripsjonen.
Mismatch-reparasjon (MMR)
Mismatch-reparasjon retter opp feil som oppstår når DNA kopieres. Selv om replikasjonsmaskineriet er svært nøyaktig og polymerasene har innebygget korrekturlesing, hender det at et feil nukleotid settes inn eller at DNA glir litt i repeterte områder slik at det dannes små løkker. Disse feilene må fjernes raskt, for ellers kan de gi permanente mutasjoner etter neste replikasjonsrunde. MMR arbeider derfor rett bak replikasjonsgaffelen og overvåker nylig syntetisert DNA for å sikre at det samsvarer med templaten.
Den første oppgaven er å oppdage selve feilen. To proteiner, MSH2 og MSH6, danner et kompleks som skanner DNA for avvik i baseparingen. Når de finner et område der basene ikke passer sammen slik de skal, binder de seg til strukturen og markerer det som trenger reparasjon. Et annet kompleks, ofte bestående av MLH1 og PMS2, rekrutteres deretter til stedet og kobler feilen til resten av reparasjonsmaskineriet. Cellen må da vite hvilken av de to trådene som er den nye, for det er der feilen sitter. Dette identifiseres ved hjelp av små brudd eller nicks i nylig syntetisert DNA, som polymerasen og ligase etterlater under replikasjonen.
Når reparasjonen starter, fjernes en del av den nye tråden som inneholder mismatchet. Et exonuklease-enzym arbeider seg fra bruddet og inn mot feilen, og lager et hull i DNA som polymerasen kan fylle igjen med riktige nukleotider. Etterpå tettes åpningen av ligase, og DNA er tilbake til en feilfri form. Hele prosessen skjer raskt og presist, og den reduserer antallet replikasjonsfeil dramatisk.
MMR er også viktig i områder med korte repeterte sekvenser, såkalte mikrosatellitter. I disse områdene kan polymerasen lett gli et nukleotid frem eller tilbake og danne en liten løkke. Slike løkker ville ført til innsetting eller tap av nukleotider dersom de kopieres videre. Når MMR ikke fungerer, blir disse feilene stående, og sekvensene blir ustabile. Dette fenomenet kalles mikrosatellittinstabilitet, og det kjennetegner flere krefttyper, blant annet de som oppstår ved Lynch syndrom, der MMR-genene er mutert.
Reparasjon av dobbelttrådbrudd
Dobbelttrådbrudd er blant de mest alvorlige skadene cellen kan møte, fordi begge DNA-trådene er brutt samtidig og det ikke finnes en intakt partner å lese direkte fra i det skadde området. Disse bruddene kan oppstå ved ioniserende stråling, ved oksidativt stress, under replikasjon når gaffelen kollapser, eller som et resultat av enzymatiske prosesser i immunforsvaret. Når et dobbelttrådbrudd oppstår, aktiveres egne sensorer som registrerer bruddet og samler reparasjonsfaktorer i området. Cellen har to hovedstrategier for å reparere slike brudd, og valget mellom dem avhenger av hvor i cellecyklus bruddet oppstår og hvilke verktøy som er tilgjengelige.
Når cellen har tilgang til en identisk kopi av DNA, som i S- og G2-fase etter at kromosomene er duplisert, kan den bruke homolog rekombinering. Denne mekanismen er svært nøyaktig. Den starter med at endene på bruddet bearbeides av spesialiserte enzymer som lager enkelttrådede overheng. Disse enkeltrådene dekkes av proteinet RAD51, som hjelper dem med å finne søsterkromatidet. Når den riktige kopien er funnet, dannes en struktur der den skadde tråden bruker søsterkromatidet som mal. Polymerasen fyller inn de manglende nukleotidene ved å lese fra denne uskadde kopien. På denne måten gjenopprettes sekvensen uten tap av informasjon. Homolog rekombinering er avhengig av flere store proteinkomplekser, blant annet BRCA1 og BRCA2, som hjelper med å kontrollere prosessen. Når disse proteinene ikke fungerer, blir cellen mye dårligere til å håndtere dobbelttrådbrudd, og det oppstår genomisk ustabilitet som kan føre til kreftutvikling.
I celler som ikke har tilgang til en kopi av DNA, slik som i G1-fase, må bruddet repareres på en annen måte. Cellen bruker da non-homologous end-joining, en mekanisme som kobler de to endene sammen igjen uten å bruke en mal. To proteiner, Ku70 og Ku80, gjenkjenner de åpne DNA-endene og holder dem i posisjon. Deretter rekrutteres et sett av enzymer som bearbeider endene slik at de kan kobles sammen. Noen ganger må små nukleotider fjernes eller legges til for å få strukturen til å passe, og derfor kan NHEJ føre til små mutasjoner rundt bruddet. Til slutt tetter ligase komplekset bruddet. Selv om denne metoden ikke er like nøyaktig som homolog rekombinering, er den rask og ofte nødvendig for å forhindre at bruddet fører til kromosombrudd og større strukturelle feil.
Begge mekanismene er avgjørende for cellens overlevelse. Homolog rekombinering bevarer informasjonen og sikrer stabilitet når en kopi er tilgjengelig, mens NHEJ redder cellen i situasjoner der den må handle raskt for å forhindre alvorlig kromosomal skade. Når noen av disse systemene svikter, blir dobbelttrådbrudd stående lenger eller reparert feil, og cellen kan utvikle mutasjoner, translokasjoner eller tap av kromosomdeler. Dette understreker hvorfor nøyaktig reparasjon av dobbelttrådbrudd er en av de mest kritiske funksjonene i genomet.
DNA skader og sykdom
En viktig sammenheng mellom DNA-skade og sykdom sees i utviklingen av kreft. Kreftceller bærer ofte et stort antall mutasjoner som har hopet seg opp gjennom mange celledelinger. Noen av mutasjonene gir cellen fordeler, som raskere deling eller redusert evne til å gå inn i apoptose, og slik får cellen et konkurransefortrinn i vevet. Andre mutasjoner påvirker reparasjonssystemene selv. Når for eksempel gener som BRCA1, BRCA2, MLH1 eller andre sentrale reparasjonsproteiner endres, svekkes cellens evne til å rette opp nye skader. Mutasjoner begynner da å akkumuleres raskere, og genomet blir mer ustabilt. Dette kan føre til at hele kromosomer eller deler av dem går tapt eller bytter plass, og cellen får en utviklingsretning som gjør den stadig mer uregulert.
I noen sykdommer er reparasjonssystemet så svekket at konsekvensene blir tydelige allerede tidlig i livet. Personer med Xeroderma pigmentosum, som mangler en fungerende NER-mekanisme, får store mengder UV-skade i huden som ikke fjernes. Selv kortvarig soleksponering fører til mutasjoner, og risikoen for hudkreft øker dramatisk. Ved Lynch syndrom, der mismatch-reparasjon ikke fungerer som den skal, oppstår mutasjoner hyppig i repeterte sekvenser i genomet. Dette gir mikrosatellittinstabilitet og en økt risiko for tykktarmskreft og flere andre kreftformer. Felles for disse sykdommene er at en defekt i et enkelt reparasjonssystem fører til et bredt spekter av mutasjoner fordi cellen ikke lenger klarer å holde genomet stabilt.
DNA-skader spiller også en rolle i aldringsprosessen. Etter hvert som celler deler seg gjennom livet, oppstår det små skader som ikke alltid blir reparert helt nøyaktig. Selv om mutasjonene som oppstår ofte er harmløse, kan de over tid påvirke gener i vevet slik at funksjonen gradvis svekkes. Celler som ikke klarer å reparere skadene, går ofte inn i senescens eller dør gjennom apoptose, og dette bidrar til at vev mister regenerasjonsevne. I organer som er avhengige av kontinuerlig fornyelse, som hud og tarm, kan dette være særlig merkbart.
DNA-skader er derfor ikke bare en trussel mot stabilitet i genomet, men en viktig faktor i utviklingen av sykdom og i kroppens aldring. Hvor godt reparasjonssystemene fungerer, hvor raskt skader oppdages, og hvordan cellen velger å håndtere dem, avgjør om en skade forsvinner uten spor, eller om den blir starten på en sykdomsprosess. Genomet er dermed mer enn en informasjonsbærer – det er et system som kontinuerlig må vedlikeholdes for at kroppen skal beholde normal struktur og funksjon gjennom hele livet.