Prinsippet bak lysmikroskopet

Forstørrelse og fokus:
Lysmikroskopet bruker konvekse linser for å bøye lyset (refraksjon). Dette skjer i to trinn:
- Først passerer lyset gjennom objektivlinsen, som skaper et reelt, opp-ned bilde
- Deretter går lyset gjennom okularlinsen, som forstørrer dette bildet ytterligere
Når lyset treffer de konvekse linsene, brytes strålene innover og samles i et fokuspunkt. Dette skaper et klart, forstørret bilde som projiseres på netthinnen. Jo mer konveks linsen er, desto kraftigere blir forstørrelsen.

Komponenter i lysmikroskopet

Okular:
- Forstørrer bildet ytterligere, typisk med 10x forstørrelse.
Objektiv:
- Kommer i ulike forstørrelsesgrader, som 4x, 10x og 40x.
- Total forstørrelse = okular x objektiv (f.eks. 10x * 40x = 400x).
Kondensor:
- Samler og fokuserer lyset fra lyskilden på prøvematerialet.
Lyskilde:
- Sender lys gjennom prøven for å skape kontrast.

Numerisk apertur (NA)

Definisjon: NA er et tall som forteller hvor godt mikroskopet kan samle inn lys. Jo høyere NA, desto bedre blir bildekvaliteten. NA påvirker både oppløsning og lysstyrke.
To viktige faktorer:
- Refraksjonsindeks (n): Et mål på hvordan lyset bremses i ulike medier
  - Luft (n = 1,00): Gir dårligst bildekvalitet
  - Vann (n = 1,33): Gir bedre bildekvalitet
  - Immersjonsolje (n = 1,52): Gir best bildekvalitet, brukes ved høy forstørrelse
- Vinkel (θ): Jo større vinkel objektivet kan fange lys fra, desto bedre blir NA
Formel: NA = n⋅sin(θ)
- Eksempel: Et 40x objektiv med NA = 0,95 gir bedre bildekvalitet enn et med NA = 0,65
- Klinisk betydning: Høyere NA gjør at du kan se flere detaljer i vevsprøver

5. Optisk oppløsning og Abbes grense

Abbes grense – en fundamental begrensning
Dette er den minste avstanden mellom to punkter som mikroskopet kan skille fra hverandre – tenk på det som mikroskopets “synsskarphet”.
Jo mindre denne avstanden er, desto flere detaljer kan du se i vevsprøven.
Hvordan beregnes grensen?
- Formelen er: Δd = λ/(2·NA) hvor:
- λ (lambda) er lysets bølgelengde
- NA er numerisk apertur (NA = n⋅sin(θ))
- Δd er minste avstand som kan oppløses
- θ (theta) er maksimal vinkel for lysinnsamling (maks 60°)
Praktisk eksempel
- Med vanlig mikroskopi (NA = 0,87) og fiolett lys (400 nm): Δd = 400/(2·0,87) ≈ 230 nm
- Dette betyr at strukturer mindre enn 230 nm vil fremstå som ett punkt – dette er viktig å huske når du studerer cellulære strukturer!
Klinisk relevans
- 230 nm er tilstrekkelig for å se cellekjerner og større organeller
- For å se mindre strukturer som ribosomer (20-30 nm) må man bruke elektronmikroskop

Forberedelse av vevsprøver (biopsier)

Før mikroskopisk undersøkelse gjennomgår vevsbiter flere viktige trinn for å bevare struktur og forberede snitt:
- Fiksering:
  - Formalin brukes for å bevare vev ved å lage kovalente bindinger mellom proteiner og mellom proteiner og DNA.
  - Dette hindrer nedbrytning og bevarer den cellulære strukturen.
- Prosessering:
  - Etter fiksering legges vevsbitene på blokker, behandles og støpes inn i parafin.
- Snitting:
  - Tynne snitt (ca. 5 µm) kuttes fra parafinblokkene og legges på mikroskopglass.

Farging av vev

Uten farging:
- Vevet ser fargeløst ut og gir lite informasjon i mikroskopet.
Hematoksylin-Eosin (HE)-farging:
Standardmetoden i histopatologi – brukes på >95% av alle vevsprøver for diagnostikk.
Hematoksylin:
- Et basisk fargestoff som binder seg til negativt ladde molekyler som DNA og RNA
- Gir cellekjerner en karakteristisk mørkeblå/fiolett farge
- Gjør det enkelt å vurdere kjernenes størrelse, form og kromatinmønster – viktig for kreftdiagnostikk
Eosin:
- Et surt fargestoff som binder seg til positivt ladde proteiner i cytoplasma
- Farger cytoplasma rosa og kollagenfibre sterkt røde
- Varierende fargeintensitet hjelper å skille ulike celletyper og vevskomponenter
Tidligere HES-farging:
- Brukte Hematoksylin, Eosin og Safran. Safran ble brukt for å farge kollagen gult.

Immunhistokjemi og relaterte diagnostiske metoder

Immunhistokjemi (IHC)

Funksjon: Påviser spesifikke proteiner eller celletyper i vevsprøver.
Bruker primære antistoffer for å binde til spesifikke antigener. Og sekundære antistoffer merket med fluoroforer eller enzymer brukes for visualisering.
Deteksjon:
- Fluorescensbasert: Sekundære antistoffer med fluoroforer gir fluorescerende signaler.
- Kolorimetrisk: Enzymer produserer farge ved reaksjon med substrater.
Brukes for å identifisere proteiner for spesifikk kreftdiagnostikk (f.eks. cytokeratin for hudkreft).

Tilleggsundersøkelser

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

Påviser genetiske forandringer, som genfusjoner eller amplifikasjoner.
Gjøres ved at DNA-prober binder seg til spesifikke genetiske sekvenser.
Eksempel: BCR-ABL-genet i kronisk myelogen leukemi (KML).

Immunfluorescens (IF)

Påviser antistoffer assosiert med autoimmune sykdommer.
Denne visualiserer immunkomplekser i vev ved bruk av fluorescerende markører.
Eksempel: Diagnostikk av glomerulonefritt.

Farging av vev og strukturidentifikasjon

HES-farging:
- Hematoksylin: Farger cellekjerner mørk blå.
- Eosin: Farger cytoplasma rosa.
- Safran: Farger kollagent bindevev gult.
Eksempel:
- Snitt fra hud viser tydelig forskjell mellom cellekjerner, cytoplasma og ekstracellulære fibre.

Tre bilder under har jeg screenshottet fra Olyvia. Alle er bilder av hud, snitt 2, ekse A.

Artefakter i histologiske snitt

Feil eller uregelmessigheter som kan oppstå under preparering, som bretter, forurensning eller ujevn farging.
Identifikasjon:
- Bretter sees ofte som “dobbeltfargede” striper.
- Forurensning kan føre til uønskede flekker eller mønstre i snittet.

3. 2D-fremstilling av en 3D-verden

Utfordring:
- Histologiske snitt viser tredimensjonale strukturer i to dimensjoner.
- Eksempel: Tverrsnitt og lengdesnitt av en hårfollikkel ser svært forskjellige ut.
Praktisk eksempel:
- Hårfollikkelens struktur i tverrsnitt (bilde 1) kan identifiseres igjen i lengdesnitt (bilde 2)

Identifisering av små strukturer

Eksempel:
- Snitt fra lunge (40x forstørrelse) viser cilia/flimmerhår som små trådformede utløpere fra celleoverflaten. Her møter vi Abbes grense!
- Flimmerhårene er viktige for funksjon som transport av slim og partikler.

6. Immunhistokjemi (IHC)

Funksjon: Påviser spesifikke proteiner i vevet og gir informasjon om sykdommer.
Eksempel:
- Farging med antistoffer mot P16 og Ki67 i cervix for å påvise HPV-virusinfeksjon og celledelingsmarkører.
- Kombineres ofte med hematoksylin for å visualisere cellestrukturer.

Ekstra informasjon for moroskyld:

Kjennetegn på høygradig dysplasi i livmorhalsen

Så på bildet jeg har screenshottet fra Olyvia over!

Cellearkitektur:
- De rødfargede områdene representerer epitelceller med unormal vekst og struktur.
- Kjernene er forstørrede, hyperkromatiske (mørke) og irregulære, noe som er typisk for dysplastiske celler.
Immunhistokjemisk markering:
- Den brunfargede kjernefargingen viser positivitet for Ki67, en proliferasjonsmarkør. Dette indikerer økt celleproliferasjon i de dysplastiske områdene, som er et viktig kjennetegn på høygradig dysplasi.
- P16 (ofte brukt i kombinasjon med Ki67) kan også være til stede, noe som peker mot infeksjon med høyrisikotyper av humant papillomavirus (HPV).
Blå bakgrunnsfarge:
- Representerer normale celler og bakgrunnsvev. Det viser kontrast til de dysplastiske områdene, som er tydelig markert.

Histologisk tolkning av bildet

De tydelige røde områdene viser høy proliferasjonsaktivitet (mot antistoffet P16), noe som understøttes av Ki67-positivitet (de brune flekkene).
De store, pleomorfe og hyperkromatiske cellekjernene er karakteristiske for høygradig dysplasi.
Den blå bakgrunnen viser normalt vev og gir referanse for å vurdere de patologiske endringene. Farget av eosin!