PSSSST! Denne er ikke ferdig.

Genkartlegging handler om å beskrive hvordan gener er plassert i genomet og hvordan denne plasseringen kan brukes til å forstå arvelige egenskaper og sykdommer. Det humane genomet inneholder et stort antall proteinkodende gener, i tillegg til mange gener som koder for ulike typer RNA. Hvert gen har en bestemt posisjon langs DNA, og denne posisjonen kan undersøkes og beskrives på ulike måter.

Ved å kartlegge gener får vi et systematisk bilde av hvor i genomet et gen befinner seg, hvilke andre gener som ligger i nærheten, og hvilke markører som kan brukes til å følge arven av et bestemt kromosomsegment i en familie. Denne oversikten gjør det mulig å knytte genetiske varianter til sykdom, identifisere gener som er involvert i arvelige tilstander og forstå hvordan genetiske forandringer påvirker biologiske prosesser.

To hovedtyper genkart

Genkart kan beskrive gener på to ulike måter: ved å vise deres nøyaktige plassering langs DNA eller ved å vise hvordan de nedarves i forhold til hverandre. Disse to perspektivene utfyller hverandre og gir ulike typer informasjon.

Fysiske genkart viser hvor et gen befinner seg på kromosomet, målt i basepar. Dette er et kart som bygger på laboratoriebaserte metoder som lokaliserer en bestemt DNA-sekvens direkte. Resultatet er en konkret og geografisk plassering: hvor genet ligger, hvilke gener som omgir det, og hvordan den lokale genstrukturen ser ut.

Genetiske kart viser avstanden mellom loci målt gjennom rekombinasjon. Her beskrives ikke nøyaktig fysisk posisjon, men sannsynligheten for at to markører skiller lag under meiosen. Avstanden uttrykkes i centiMorgan (cM), og kartet gir et bilde av hvordan kromosomet oppfører seg når det deles og deles videre mellom generasjoner.

Til sammen gjør disse kartene det mulig både å lokalisere gener presist og å forstå hvordan de nedarves.

Fysiske genkart

Fysiske genkart beskriver den nøyaktige posisjonen til et gen langs DNA-molekylet. Dette kartet er et direkte bilde av genomet, basert på metoder som undersøker selve DNA-strukturen. Plasseringen angis i basepar, kilobase eller megabase, og kartet gir derfor en konkret forståelse av hvor et gen ligger i forhold til andre gener eller markører på samme kromosom.

Hvordan fysiske genkart lages

Arbeidet med fysiske kart tar utgangspunkt i metoder som kan identifisere spesifikke DNA-sekvenser. En vanlig tilnærming er å bruke korte DNA-fragmenter (prober) som binder seg til komplementære sekvenser på kromosomer eller i isolert DNA. Ved å merke disse probene med fluorescens eller andre sporingssignaler, kan man se hvor de binder seg og dermed angi plasseringen til et bestemt gen.

Et fysisk kart gir derfor informasjon om hvor på kromosomet et gen befinner seg, og hvilke nabogener som ligger i samme område. Dette gir et romlig perspektiv på genomet som genetiske kart alene ikke kan gi.

Hybridiseringsteknikker: FISH og lignende metoder

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en metode som gjør det mulig å se hvor et bestemt DNA-fragment befinner seg på et kromosom. Teknikken begynner med at man lager et preparat av metafasekromosomer, der kromosomene ligger tett pakket og er tydelig synlige under mikroskop. Disse spres ut på et objektglass og behandles slik at DNA-et delvis åpnes og blir tilgjengelig for binding.

En probe som er designet til å kjenne igjen en bestemt sekvens, tilsettes deretter. Proben er merket med et fluorescerende stoff som gjør den synlig i mikroskopet. Når proben finner sitt komplementære område på kromosomet, danner den en stabil binding. Under fluorescensmikroskop vil dette vises som et lite lysende punkt på et spesifikt sted på kromosomet. Dette punktet forteller hvilken region proben har bundet til.

FISH kan utføres med flere forskjellige prober samtidig. Hvis hver probe får sin egen farge, kan man undersøke om to gener ligger nær hverandre, om de har byttet plass, eller om et kromosomsegment mangler eller er duplisert. Denne flerfargevarianten brukes ofte når man undersøker strukturelle kromosomavvik, som deletasjoner, duplikasjoner, translokasjoner eller amplifikasjoner. Et avtrykk som mangler et signal, eller har et signal på feil kromosom, kan gi verdifull diagnostisk informasjon.

Hvordan prober lages

En probe fremstilles for å kunne gjenkjenne en bestemt DNA-sekvens i genomet. Prosessen kan forstås tydelig når hvert steg forklares med et konkret eksempel.

1. Man starter med kjent informasjon.
Tenk at man har isolert et protein fra en pasient, og man kjenner en liten aminosyresekvens fra proteinet, for eksempel “Leu–Gly–Ala”. Denne sekvensen kan oversettes til DNA fordi man vet hvilke kodoner som kan kode for disse aminosyrene. Leucin kan f.eks. kodes av TTA, TTG, CTA, CTG, CTC eller CTT. Dette gir en håndfull mulige DNA-kandidater som alle kan være riktige.

2. Man lager degenererte DNA-fragmenter.
Siden man ikke vet hvilket kodon genet faktisk bruker, lager man en blanding av korte DNA-fragmenter som dekker alle mulighetene. For aminosyrene over kan et degenerert fragment se slik ut:
5’- YTN GGN GCN –3’
Her er Y, N og N “joker-bokstaver” som betyr at flere mulige baser godtas. Dette gir en familie av prober som sammen dekker alle realistiske alternativer.

3. Man merker proben.
Fragmentene merkes slik at de blir synlige når de binder seg. Et fluorescerende merke er vanlig i moderne laboratorier. Etter merking vil hvert DNA-fragment fortsatt være komplementært til sin mulige målsekvens, men nå kan det oppdages i mikroskop eller ved signal på membran. Hvis fragmentet binder til riktig DNA, vil det lyse.

4. Man lar proben søke i et DNA- eller cDNA-bibliotek.
Et cDNA-bibliotek består av mange bakteriekolonier der hver koloni inneholder ett bestemt cDNA-fragment, altså en DNA-kopi av et mRNA-molekyl fra den cellen biblioteket ble laget fra. Hvis biblioteket kommer fra lever, betyr det at hver koloni representerer ett av genene som faktisk uttrykkes i leverceller. Disse koloniene kan overføres til en membran slik at hvert DNA-fragment ligger som et lite avtrykk på membranens overflate.

Når DNA-et på membranen denatureres, blir det enkelttrådet og dermed tilgjengelig for hybridisering. Den merkede proben tilsettes og får tid til å binde seg til enhver sekvens som er komplementær. I praksis vil proben prøve ut alle DNA-avtrykkene på membranen. Dersom én av probevariantene inneholder en sekvens som passer nøyaktig med et av cDNA-fragmentene, danner de et stabilt dobbelttrådet område. Det merkede signalet gjør denne bindingen synlig, slik at et bestemt punkt på membranen lyser opp.

Dette punktet forteller nøyaktig hvilken bakteriekoloni som inneholder cDNA-fragmentet proben bandt til. Når denne kolonien hentes tilbake fra biblioteket, kan man isolere cDNA-et og undersøke det nærmere. Dermed har man identifisert det første stykket av genet man leter etter.

5. Man henter ut fragmentet som ga signal.
Hvis én koloni lyser opp, vet man at denne inneholder et DNA-fragment som matcher deler av genet man leter etter. Man kan plukke kolonien, isolere plasmidet og sekvensere innsatt DNA. Dette gir et første glimt av genet. Derfra kan man lage en ny, mer spesifikk probe basert på den faktiske sekvensen man fant, og bruke denne proben til å lete etter resten av genet i et genomisk bibliotek.

DNA-biblioteker og vektorkloning

En DNA-bibliotek brukes for å lagre og undersøke små biter av genomet på en systematisk måte. For å lage et slikt bibliotek starter man med å isolere alt DNA fra en celle. Dette DNA-et er langt og sammenhengende, og for å gjøre det håndterbart kuttes det opp i mindre fragmenter med restriksjonsenzymer. Disse enzymene fungerer som molekylære sakser og klipper DNA ved bestemte sekvenser, noe som gir en stor samling overlappende fragmenter fra hele genomet.

Hvert av disse fragmentene settes deretter inn i en vektor. En vanlig vektor er et bakterielt kunstig kromosom (BAC), som er et lite DNA-molekyl som bakterier kan kopiere stabilt og i stort antall. Når et fragment settes inn i en slik vektor, kan det overføres til en enkelt bakteriecelle. Denne bakterien vil så dele seg og lage en hel koloni, og alle cellene bærer det samme fragmentet av genomet. Resultatet er at én bakteriekoloni representerer én spesifikk bit av DNA-et som opprinnelig ble hentet fra genomet.

Når et stort antall slike kolonier er samlet, har man et komplett DNA-bibliotek: hver koloni inneholder sitt eget genomfragment, og til sammen representerer koloniene hele organismens genom. Dette gjør det mulig å undersøke individuelle fragmenter ett og ett, i stedet for å forsøke å analysere hele genomet som én stor enhet.

For å kartlegge et område av et kromosom kan disse fragmentene sekvenseres. Når man sammenligner sekvensene fra mange kolonier, vil man se hvilke DNA-fragmenter som overlapper hverandre. Overlappingen gir informasjon om rekkefølgen av fragmentene. Ved å legge overlappende sekvenser etter hverandre, kan man gradvis bygge opp lengre og lengre strekninger av DNA. Til slutt kan man sette sammen en sammenhengende sekvens som beskriver hele kromosomet. Dette prinsippet ble brukt i tidlige kartleggingsprosjekter som Human Genome Project, og metodikken er fortsatt en viktig del av moderne genomarbeid, selv om sekvenseringsteknologien i dag er mer effektiv.

Sekvensering og moderne kartlegging

Sekvensering av DNA har gjort fysisk kartlegging mer presis og langt raskere. Tidligere ble sekvensering utført med Sanger-metoden, som analyserte DNA i korte fragmenter. Disse fragmentene måtte settes sammen som puslespill, noe som krevde tid og omfattende beregninger.

Moderne sekvenseringsteknikker gjør det mulig å lese millioner av DNA-fragmenter samtidig. Dette gir svært detaljerte kart over genomet og gjør det enklere å finne gener i et område av interesse. Disse kartene brukes i dag som referanse i databaser og danner et felles grunnlag for forskning, genetisk diagnostikk og kliniske analyser.

Eksempler på fysiske kart

Fysiske genkart brukes blant annet til å vise hvor sykdomsgener ligger. Monogene sykdommer kan kobles til bestemte kromosomregioner, og kartet viser nøyaktig hvor mutasjonen befinner seg. Denne informasjonen gjør det mulig å undersøke strukturen rundt genet, identifisere regulatoriske områder og utvikle tester som påviser mutasjoner i klinisk praksis.

Genetiske genkart

Genetiske genkart beskriver avstanden mellom loci basert på hvor ofte de separeres under meiosen. I stedet for å vise nøyaktig fysisk plassering, gir de et mål på hvor sannsynlig det er at to områder av DNA følger hverandre når egg- eller sædceller dannes. Kartene gir dermed innsikt i kromosomenes dynamikk og hvordan genetisk variasjon oppstår og nedarves.

Rekombinasjon

Rekombinasjon skjer når homologe kromosomer ligger tett sammen under meiosen og danner chiasmata. I disse kontaktpunktene kan det skje en overkryssing der kromatidene bytter DNA-segmenter. Resultatet er nye kombinasjoner av alleler. Sannsynligheten for at det oppstår en overkryssing mellom to loci avhenger i stor grad av avstanden mellom dem. Dersom to loci ligger tett, vil en overkryssing sjelden oppstå mellom dem, og de vil derfor som regel føres videre sammen. Ligger de derimot langt fra hverandre, øker sannsynligheten for at de separeres i meiosen. Rekombinasjon er et sentralt prinsipp i genetisk kartlegging, fordi hyppigheten av overkryssinger kan brukes som et indirekte mål på avstanden mellom loci.

Rekombinante gameter

Når en person lager kjønnsceller, ligger to homologe kromosomer ved siden av hverandre. Hver av dem har sine egne markørvarianter, for eksempel:

• den ene kromosomkopien har markørvariantene A–B
• den andre kromosomkopien har variantene a–b

Normalt ville en gamet få enten A–B eller a–b, fordi hver gamet får én av kromosomkopiene. Dette er parentale gameter, fordi de gjenspeiler de opprinnelige kromosomene slik de var hos forelderen.

Under meiosen kan det imidlertid skje en overkryssing mellom de to kromosomene, der de bytter et stykke DNA med hverandre. Hvis dette skjer mellom markørene A og B, vil kombinasjonene som dannes bli nye:

• A på samme kromosom som b
• a på samme kromosom som B

Disse kombinasjonene fantes ikke før, og gametene som inneholder dem, kalles rekombinante gameter.

Rekombinante gameter betyr derfor bare:
gameter som har fått en ny kombinasjon av markører fordi det skjedde en overkryssing mellom dem.

Når man analyserer et barns markører, ser man hvilken kombinasjon som må ha kommet fra mor eller far. Hvis kombinasjonen barnet har ikke fantes på noen av foreldrenes kromosomkopier som “ferdige pakker”, må det ha skjedd en rekombinasjon i den gameten som ble brukt til å lage barnet.

Hvis dette skjer sjelden, ligger markørene nær hverandre. Hvis det skjer ofte, ligger markørene lenger fra hverandre. Dette er grunnlaget for å beregne rekombinasjonsfrekvens og dermed genetisk avstand.

Markører og fase

En genetisk markør er ganske enkelt et sted i DNA som finnes i flere varianter i befolkningen. Det kan være et repetert mønster eller en liten sekvensforskjell. Poenget er at markøren lar oss se forskjell på de to kromosomkopiene hos samme person.

For å forstå rekombinasjon må vi vite hvilke markørvarianter som ligger på samme kromosomkopi hos forelderen. Dette kalles fase.

Hvis mor har markørene:

• A og B på den ene kromosomkopien
• a og b på den andre

… så sier vi at fasen hennes er A–B og a–b.

Når vi kjenner fasen, vet vi hva en parental gamet skal se ut som. Hvis barnet får en kombinasjon som bryter med fasen, for eksempel A og b, vet vi at dette ikke kom fra en av de to opprinnelige kromosomkopiene, og at det derfor må ha skjedd en rekombinasjon.

Uten faseinformasjon blir dette umulig, fordi kombinasjonene A–b og a–B kunne sett helt like ut i et laboratorium som kombinasjonene A–B og a–b. Det er derfor fasen må være kjent før man kan bestemme om en gamet er rekombinant eller parental.

centiMorgan og rekombinasjon

Genetiske avstander angis i centiMorgan, der én centiMorgan tilsvarer én prosent sannsynlighet for rekombinasjon mellom to loci i en enkelt meioserunde. Hvis to markører ligger så nær hverandre at rekombinasjon mellom dem oppstår i bare ett av hundre gameter, sies avstanden å være én centiMorgan. Dersom rekombinasjon oppstår hyppigere, blir avstanden tilsvarende større. Det finnes imidlertid en øvre grense på femti prosent. Når rekombinasjon oppstår i halvparten av meiosene, vil de to markørene fremstå som ukoblede, fordi fordelingen av kombinasjoner da ikke kan skilles fra tilfeldig segregering. Derfor kan genetiske avstander aldri overstige femti centiMorgan, selv om den fysiske avstanden kan være betydelig.

Forskjeller mellom kjønn

Rekombinasjonsfrekvensene er ikke like i kvinnelig og mannlig meiose. Kvinner har generelt flere chiasmata per meiosesyklus, noe som gir høyere rekombinasjonsfrekvens. Dette gjør at genetiske kart basert på kvinnelige meioser blir «lengre» enn kart basert på mannlige. Den fysiske avstanden i basepar er den samme, men når avstand måles som sannsynlighet for rekombinasjon, fremstår kvinnelige kart som mer utstrakte. Disse forskjellene er viktige når man tolker genetiske analyser, fordi avstander og kobling må vurderes med tanke på hvilket kjønn meiosen stammer fra.

VNTR som genetiske markører

Mange genetiske kart bygger på markører som varierer i lengde mellom individer. En vanlig type slike markører er VNTR, som står for Variable Number of Tandem Repeats. En VNTR består av et kort DNA-motiv som er gjentatt flere ganger rett etter hverandre. Antallet repetisjoner kan variere fra person til person, men også mellom de to kromosomkopiene hos samme individ. Det betyr at én person kan ha en VNTR med for eksempel seks repetisjoner på det ene kromosomet og ti repetisjoner på det andre.

Siden VNTR-lengden er forskjellig fra individ til individ, kan man bruke dem til å skille de to kromosomkopiene fra hverandre. Når en VNTR forstørres ved PCR og analyseres i et system som skiller DNA-fragmenter etter størrelse, vil fragmentet med mange repetisjoner vandre litt saktere enn fragmentet med få repetisjoner. Det gir et mønster av bånd eller topper som gjør det mulig å identifisere hvilken variant mor og far har, og hvilken variant barnet har arvet fra hver av dem.

Dette gjør VNTR svært egnet som markører i koblingsanalyser. Tilstedeværelsen av flere mulige alleler øker sjansen for at foreldre og barn har tydelige forskjeller som lar seg spore. Når man vet hvilke VNTR-varianter som ligger på samme kromosom hos en forelder, kan man følge dem inn i neste generasjon og se om overkryssing har skjedd. Hvis barnet mottar en variantkombinasjon som ikke fantes på noen av foreldrens to kromosomer slik de forelå før meiosen, indikerer det at rekombinasjon har skjedd mellom VNTR-markøren og den andre markøren man studerer.

VNTR-markører brukes fordi de er enkle å analysere, gir tydelige forskjeller mellom alleler og gjør det mulig å identifisere rekombinante gameter med høy presisjon. Dette er grunnlaget for å kunne måle rekombinasjonsfrekvenser og dermed konstruere genetiske kart, der avstanden mellom markører uttrykkes som hvor ofte de separeres under meiosen.