Molekylærgenetiske metoder er verktøyene som gjør det mulig å lese, forstå og analysere arvematerialet vårt. Disse metodene gjør at vi kan undersøke både DNA, RNA og kromosomer, og dermed avdekke genetiske varianter som kan ha betydning for sykdom, behandling og arvelighet. Med dagens teknologi kan vi identifisere alt fra enkeltbaseendringer til store kromosomfeil, og vi kan til og med kartlegge hele arvematerialet i én analyse.

I medisinen brukes slike analyser først og fremst for å finne årsaker til sykdom, og for å kunne tilpasse behandlingen til den enkelte pasient. I genetisk utredning kan vi oppklare arvelige tilstander i familier, oppdage mutasjoner som forklarer pasientens symptomer, eller fastslå hvilke familiemedlemmer som kan være bærere av en variant. I kreftdiagnostikk brukes metodene til å identifisere genetiske endringer i svulster, både for å finne diagnose og for å velge målrettet behandling. I farmakogenetikk kan analyser av genetiske variasjoner gi informasjon om hvor raskt en pasient bryter ned et legemiddel, og om dosen bør justeres.

Molekylærgenetiske metoder brukes også i populasjonsstudier, rettsmedisin og forskning, men i denne sammenhengen ligger fokuset på hvordan de brukes i klinikk og genetisk diagnostikk. En viktig del av feltet handler om å velge riktig metode til riktig problemstilling. Noen teknikker kan oppdage svært små forandringer, som en enkelt nukleotidendring, mens andre er utviklet for å finne større strukturelle avvik som delesjoner, duplikasjoner og translokasjoner. Fordi ingen metode kan avdekke alle typer genetiske endringer, må laboratoriet velge teknikk basert på hva man mistenker, og hva man ønsker å finne.

Mange av metodene bygger på de samme biologiske prinsippene, spesielt hybridisering – evnen DNA- og RNA-tråder har til å binde seg til komplementære sekvenser. Dette gjør det mulig å bruke prober og primere for å finne akkurat den sekvensen man vil undersøke, amplifisere den, eller visualisere den i en celle eller på et kromosom. I tillegg har utviklingen av moderne sekvenseringsteknologi gjort det mulig å lese store mengder genetisk informasjon raskt og presist, og dette har revolusjonert både klinisk genetikk og medisinsk forskning.

Hybridisering

Hybridisering beskriver prosessen der enkelttrådige nukleinsyrer binder seg til komplementære sekvenser. Dette skjer når nukleotidene møter sin faste partner: adenin med tymin eller uracil, og cytosin med guanin. Siden baseparene alltid følger denne regelen, kan korte DNA- eller RNA-fragmenter lages slik at de kun binder seg til ett bestemt område i arvematerialet.

Når dobbeltrådet DNA varmes opp, løsner hydrogenbindingene mellom baseparene, og molekylet går over til to enkelttråder. Når forholdene normaliseres, vil disse trådene spontant søke tilbake til komplementære sekvenser og danne nye basepar. Denne mekanismen er helt grunnleggende for mange genetiske metoder, fordi den gjør det mulig å finne og gjenkjenne et spesifikt genetisk mål i en kompleks blanding.

Hybridisering brukes både med DNA og RNA. Forskjellen er kun at uracil i RNA tar rollen til tymin, men baseparingsprinsippet er det samme. Metoder som krever høy spesifisitet benytter strenge hybridiseringsforhold, der temperatur og saltkonsentrasjon justeres slik at kun helt komplementære sekvenser kan binde seg stabilt. Ved mindre strenge forhold kan også sekvenser med enkelte mismatch bindes.

Prober og primere

Prober og primere er korte nukleinsyrefragmenter som brukes for å gjenkjenne og binde bestemte DNA- eller RNA-sekvenser. De bygger på hybridiseringsprinsippet, men har ulike funksjoner og brukes i ulike typer analyser.

En probe er oftest et litt lengre enkelttrådig DNA- eller RNA-fragment som er merket med et signal, for eksempel et fluorescerende molekyl. Et fluorescerende molekyl er rett og slett et stoff som lyser når det får lys på seg. Den er laget slik at den binder seg til et helt bestemt område i arvematerialet. Når proben har bundet sitt mål, kan signalet registreres, og sekvensen den binder til kan identifiseres. Prober brukes blant annet i metoder der man ønsker å påvise en spesifikk sekvens, enten uten å kopiere den – slik som i kromosomanalyser – eller samtidig som man kopierer den, slik som i real-time PCR.

Primere er kortere enkelttrådige DNA-fragmenter som brukes når en sekvens skal kopieres av en DNA-polymerase.
En polymerase kan ikke starte syntesen av DNA alene; den må ha en fri 3’-hydroksylgruppe som utgangspunkt. Primerens oppgave er derfor å feste seg til målsekvensen og gi polymerasen en startplass. Bare når primere binder korrekt, kan DNA-syntesen begynne og forløpe videre. Primerne bestemmer dermed hvilke områder av DNA som blir amplifisert, og de må designes presist for å unngå uspesifikk binding.

Både prober og primere lages med kjente basesekvenser som passer eksakt til målområdet. Lengden, smeltetemperaturen og sekvensens innhold av GC-baser påvirker hvor sterkt og hvor spesifikt de binder. Hvis proben binder for svakt får du lite signal, og hvis primere binder feil kan reaksjonen gi et helt feil resultat.

PCR

Polymerase chain reaction, PCR, er en metode som gjør det mulig å lage store mengder av en bestemt DNA-sekvens. Metoden bygger på vekslende temperatursteg som gjør at DNA-trådene skilles, primere får feste, og polymerasen kan kopiere målområdet. Hver syklus dobler mengden av det aktuelle fragmentet, og etter mange sykluser har man en mengde som er stor nok til analyse.

PCR krever en DNA-prøve som inneholder målsekvensen, to primere som binder henholdsvis til hver sin side av området som skal kopieres, frie nukleotider, og en termostabil DNA-polymerase. Polymerasen må tåle høy temperatur, fordi reaksjonen gjentas i mange runder med oppvarming og nedkjøling.

Metoden skjer i tre trinn som gjentas i sykluser.
Først varmes prøven slik at dobbeltrådet DNA denaturerer og blir enkelttrådig.
Deretter senkes temperaturen slik at primerne kan hybridisere til målsekvensene. Til slutt skrus temperaturen opp til det nivået polymerasen jobber best på, og da kan den forlenge primerne og bygge nye DNA-tråder. Når syklusen er fullført, består prøven av både gammelt og nykopiert DNA, og neste runde vil gi ytterligere fordobling.

PCR gir et resultat som består av et stort antall identiske DNA-fragmenter. Denne oppformeringen gjør det mulig å påvise mutasjoner, analysere sekvenser, utføre genotyping og identifisere genetiske variasjoner som ellers ville vært for små til å oppdages. Teknikken er veldig følsom, og små mengder utgangsmateriale kan være nok til å gi et tydelig resultat.

Visualisering av PCR-produkter

Når et DNA-fragment er amplifisert(gjort mange kopier av) med PCR, må produktet påvises for å bekrefte at reaksjonen har fungert og for å vurdere størrelsen på fragmentet. Dette gjøres vanligvis ved å skille DNA-molekylene etter lengde, slik at hvert fragment får sin egen posisjon og kan identifiseres.

Den vanligste metoden er gelelektroforese i agarosegel. DNA har negativ ladning på grunn av fosfatgruppene i ryggraden, og når det utsettes for elektrisk strøm, beveger det seg mot den positive elektroden. Korte DNA-fragmenter beveger seg raskere gjennom gelen og havner lenger ned, mens lengre fragmenter blir liggende nærmere startpunktet. Når gelen farges med et DNA-bindende fluorescerende stoff og belyses med UV-lys, fremkommer bånd som representerer de ulike fragmentlengdene. Et korrekt PCR-produkt gir et tydelig bånd på forventet størrelse.

For mer presise analyser kan DNA skilles i kapillærelektroforese, der elektroforetisk separasjon skjer i tynne kapillærrør. Metoden har høyere oppløsning og brukes ofte i genetiske profileringsmetoder, slik som passformål, STR-analyse og detaljert fragmentanalyse.

Kliniske og rettsmedisinske anvendelser av PCR

PCR brukes i en lang rekke kliniske analyser fordi metoden gir rask, sensitiv og spesifikk påvisning av genetisk materiale. I diagnostikk kan PCR brukes til å identifisere mutasjoner, bekrefte en genetisk variant eller undersøke om en pasient bærer en sykdomsassosiert sekvens. Selv svært små mengder DNA kan være nok til å få et tydelig resultat, noe som gjør teknikken egnet i situasjoner der prøvematerialet er begrenset.

I rettsmedisin er PCR en grunnpilar for å lage genetiske profiler. Her utnyttes korte, repeterte sekvenser i genomet, såkalte STR-loci. Antallet repetisjoner varierer mellom personer, og ved å amplifisere disse områdene dannes et mønster av fragmentlengder som er karakteristisk for individet. Dette fungerer som et genetisk fingeravtrykk og brukes i identifikasjon, farskapssaker og kriminaltekniske undersøkelser.

I klinisk genetikk brukes PCR til genotyping, hvor man kan undersøke om en pasient har en bestemt variant eller mutasjon. Mange målrettede analyser for enkeltgener er basert på PCR fordi metoden er rask og billig, og fordi den gjør det mulig å undersøke ett spesifikt område med høy presisjon. Metoden brukes også i analyser der man ønsker å vite om en sekvens er tilstede i ett eller to eksemplarer, eller om en variant forekommer i mosaikkform.

PCR har også en sentral rolle i infeksjonsdiagnostikk. Her brukes teknikken til å påvise DNA eller RNA fra virus, bakterier eller parasitter. Fordi PCR kan oppdage selv svært små mengder genetisk materiale, er den egnet til å påvise infeksjoner tidlig og skille mellom ulike smittestoffer.

Real-time PCR (qPCR) og RT-PCR

Real-time PCR, ofte kalt qPCR, er rett og slett PCR der du kan følge med på hvor mye DNA som blir laget mens reaksjonen skjer. Maskinen måler et lys-signal som blir sterkere etter hvert som mer DNA dannes, og på den måten kan du både se om målet er der og hvor mye det er av det.

For å få dette lyssignalet bruker man enten et fargestoff som binder til alt dobbelttrådig DNA, eller en probe som er laget for å kjenne igjen akkurat den sekvensen man vil måle.
En vanlig type probe er TaqMan-proben. Den består av et lite DNA-stykke med et fluorescerende molekyl i den ene enden og en “quencher” i den andre. Når proben sitter sammen, holder quencheren lyset dempet slik at signalet er svakt. Under PCR-syklusen bryter polymerasen proben i stykker når den møter den, og da frigjøres det fluorescerende molekylet — og lyset øker. Jo mer mål-DNA som lages, desto sterkere blir lyssignalet.

Et sentralt begrep i qPCR er Ct-verdien. Det er rett og slett hvor mange sykluser maskinen trenger før lyset blir sterkt nok til å skille seg fra bakgrunnsstøyen. Lav Ct betyr mye målmateriale i starten. Høy Ct betyr lite. Derfor brukes qPCR for å si noe om hvor mye av et gen, et virus eller en variant som finnes i en prøve.

qPCR kan også brukes til å skille mellom ulike genetiske varianter, ikke bare til å måle hvor mye DNA som er til stede. For å få til dette lager man spesialtilpassede prober – korte DNA-biter som er designet til å passe helt perfekt til én bestemt DNA-sekvens. Tenk på dem som små “låser” som bare passer til én helt spesifikk “nøkkel”.

Hvis DNA-et i prøven har nøyaktig den sekvensen proben forventer, vil proben binde seg godt. Når den binder seg, gir den fra seg et fluorescerende signal som qPCR-maskinen kan lese av.

Men hvis det finnes en mutasjon i området – selv om det bare er én eneste base som er annerledes – vil ikke proben lenger passe like godt. Den faller lettere av, eller binder ikke i det hele tatt. Da uteblir signalet eller blir mye svakere.

På denne måten kan qPCR skille mellom to DNA-sekvenser som bare skiller seg med én base. Det betyr at man faktisk kan se i sanntid om en prøve inneholder den vanlige varianten, en mutasjon eller begge deler.

RT-PCR

Begge metodene er mye brukt i klinikken. De brukes blant annet til å påvise virus i luftveier og blod, til å analysere genetiske forskjeller som påvirker hvordan legemidler metaboliseres, og i forskning for å måle genuttrykk i celler og vev. De er raske, følsomme og enkle å automatisere, og er derfor blitt standardverktøy i moderne laboratoriediagnostikk.

DNA-sekvensering

DNA-sekvensering er metoden som gjør det mulig å lese rekkefølgen av nukleotider i et DNA-fragment.
Mens PCR kan fortelle at en bestemt sekvens er til stede, gir sekvensering den nøyaktige baserekkefølgen og avslører hvilke varianter eller mutasjoner som finnes. Det finnes to hovedprinsipper i klinisk bruk: Sanger-sekvensering og moderne høy­gjennomstrømningssekvensering, ofte omtalt som Next Generation Sequencing, NGS.

Sanger-sekvensering

Sanger-sekvensering bygger på et enkelt prinsipp: DNA kopieres, men kopieringen får lov til å stoppe på bestemte steder. For å få dette til bruker man en blanding av vanlige nukleotider og spesielle byggesteiner som kalles dideoksynukleotider (ddNTPs). Disse ser nesten helt like ut som vanlige nukleotider, men de mangler den lille 3’-OH-gruppen som enzymet vanligvis trenger for å bygge videre.

Det betyr at så snart et ddNTP bygges inn i kjeden, stopper syntesen momentant. Ingen flere baser kan legges på.

I reaksjonen lages det derfor mange DNA-fragmenter i ulike lengder. Det eneste som skiller dem, er hvor syntesen stoppet og hvert stopp skyldes at et bestemt dideoksynukleotid ble satt inn. Når disse fragmentene senere sorteres etter lengde, får man en “stige” av DNA-biter som hver ender i en kjent base.

Moderne Sanger-sekvensering bruker fluorescensmerkede ddNTPs, én farge for hver base (A, T, G og C). Dermed kan alle stoppreaksjonene kjøres i én og samme prøve. Maskinen leser fargene i rekkefølgen fragmentene passerer, og resultatet vises som et fargemønster, et kromatogram, som direkte viser DNA-sekvensen.

Sanger-sekvensering er svært nøyaktig og regnes fortsatt som “gullstandard” når man skal bekrefte mutasjoner, kontrollere mindre DNA-fragmenter eller dobbeltsjekke funn gjort med andre, mer høyoppløste metoder. Metoden passer best når man undersøker et avgrenset område, siden hver sekvensering bare dekker én bestemt del av DNA-et.

Next Generation Sequencing (NGS)

NGS er en samlebetegnelse for moderne sekvenseringsmetoder som kan lese enorme mengder DNA samtidig. I stedet for å sekvensere én DNA-bit av gangen, slik man gjør i Sanger, deles DNA-et i mange små fragmenter, og alle disse bitene sekvenseres parallelt. Resultatet er et stort datasett som senere settes sammen som et puslespill for å gjenskape hele sekvensen.

Kjernen i NGS er det som kalles massiv parallell sekvensering. De små DNA-bitene festes først til en overflate, hvor hver enkelt bit kopieres mange ganger slik at den danner en liten klynge som maskinen kan lese tydelig. Deretter sekvenseres alle disse klyngene base for base, typisk ved at maskinen registrerer hvilken base som bygges inn i øyeblikket – enten gjennom lysutslipp eller kjemiske signaler, avhengig av plattform.

NGS finnes i to hovedvarianter. Short-read teknologi leser korte DNA-fragmenter og brukes i mange kliniske genpaneler, eksomanalyser og liknende, fordi den er rask, presis og godt egnet til å fange opp enkeltbasevariasjoner.
Long-read teknologi kan lese mye lengre fragmenter og gir et bedre bilde av større strukturelle forandringer, repeterte sekvenser og komplekse områder av genomet som kortere lesninger lett mister.

Det som gjør NGS så revolusjonerende, er at metoden gjør det mulig å undersøke hele gener, store genpaneler, eksomet eller til og med hele genomet på relativt kort tid og til en brøkdel av prisen det tidligere ville kostet. Samtidig kommer det en utfordring ved at datamengden er enorm, og korrekt tolkning av variantene krever avanserte bioinformatiske analyser og god kjennskap til genetiske databaser og klinisk relevans.

Spesialiserte NGS-metoder

Whole genome sequencing

Her sekvenseres hele genomet, inkludert både kodende og ikke-kodende regioner. Metoden gir komplett oversikt over genetiske varianter og strukturelle avvik, men genererer store datamengder og krever omfattende analyse. Bruken øker i forskning og i noen tilfeller i klinisk diagnostikk.

Exome sequencing

Eksomsekvensering retter seg mot de kodende regionene i genomet, der de fleste sykdomsgivende mutasjoner ligger. Dette reduserer både kostnad og datamengde. Metoden brukes ved mistanke om arvelige sykdommer der mange gener kan være involvert.

Targeted gene panels

Her undersøkes et avgrenset sett gener som er relevant for en bestemt sykdomsgruppe, for eksempel kardiomyopatier eller nevrologiske sykdommer. Paneler gir høy dekning og nøyaktighet i utvalgte gener og er ofte førstevalget i kliniske genetiske utredninger.

Kromosomanalyser

Kromosomanalyser brukes for å undersøke større genetiske forandringer: antallavvik, strukturelle omorganiseringer og regionale tap eller gevinster av arvemateriale. Disse metodene gir et makroperspektiv på genomet og utfyller sekvenseringsteknikker som primært oppdager mindre mutasjoner. De viktigste metodene er karyotypering, FISH og array-baserte teknikker.

Karyotyper

En karyotype er en oversikt over cellens kromosomer arrangert etter størrelse og båndmønster. Analysen utføres ved at man stopper celler i metafasen, der kromosomene er mest kondenserte og synlige. Etter farging fremtrer karakteristiske mørke og lyse bånd langs hvert kromosom, og disse mønstrene brukes til å identifisere strukturelle avvik.

Karyotyper avslører forandringer som trisomier, monosomier, duplikasjoner, delesjoner, translokasjoner og ringkromosomer. Metoden gir god oversikt over hele genomet, men oppløsningen er begrenset fordi små avvik kan ligge under deteksjonsgrensen. Likevel er karyotyper uunnværlige ved store kromosomfeil, ved mistanke om balanseforstyrrelser og i diagnostikk av mange medfødte syndromer.

FISH – fluorescens in situ hybridisering

FISH er en metode der man bruker fluorescensmerkede DNA-prober som får binde seg direkte til kromosomene inne i cellene. Hver probe er designet til å kjenne igjen én bestemt DNA-sekvens. Når proben fester seg til riktig område, lyser det opp som et klart signal i mikroskopet. På denne måten kan man bokstavelig talt se om et bestemt kromosomområde er til stede, mangler eller har flyttet seg til et annet kromosom.

Metoden gjør det mulig å påvise delesjoner, duplikasjoner og translokasjoner, og den kan også brukes til å identifisere hvor et bestemt gen ligger. I kreftdiagnostikk er FISH spesielt viktig, fordi mange krefttyper kjennetegnes av helt spesifikke kromosomforandringer. For eksempel kan translokasjoner eller genamplifikasjoner ha direkte betydning for hvilken behandling pasienten bør få og hva slags prognose man kan forvente.

FISH er en rask og målrettet metode fordi proben binder direkte til kromosomet og gir et tydelig signal hvis noe er unormalt. Samtidig ligger begrensningen i nettopp dette: prober må designes for et bestemt område, så man må ha en klar mistanke om hva man ser etter. Metoden er derfor svært god når man vil undersøke et helt konkret kromosomavvik, men den egner seg ikke til bred, ukjent screening slik som NGS gjør.

CGH og array-CGH

Comparative genomic hybridization (CGH) er en metode som undersøker om det finnes forskjeller i DNA-mengde mellom en prøve og et referansemateriale. Først merker man DNA fra prøven og DNA fra referansen med hver sin fluorescerende farge. Deretter blandes de og får hybridisere mot en målflate. Når man analyserer fargemønsteret, kan man se om et bestemt område av genomet er overrepresentert (duplikasjon) eller underrepresentert (delesjon) i prøven sammenlignet med referansen.

CGH er derfor godt egnet til å oppdage kopitallsendringer, men fordi metoden kun måler mengden DNA, kan den ikke avdekke strukturelle endringer der kopitallet er uendret – som balanserte translokasjoner eller inversjoner.

Array-CGH er en videreutvikling av teknologien. Her fragmenteres DNA i små biter som hybridiseres mot titusenvis av korte, forhåndsdefinerte prober som ligger systematisk plassert på en mikroarray. Dette gir en mye høyere oppløsning enn klassisk CGH, slik at selv mikrodeletasjoner og små duplikasjoner kan oppdages. Resultatet fremstilles som et tydelig signalmønster som viser hvilke kromosomregioner som har økt eller redusert kopitall.

Array-CGH har i dag blitt en standardmetode i utredning av utviklingsforstyrrelser, medfødte misdannelser og genetiske sykdommer med uklart opphav. Metoden gir svært høy presisjon for kopitallsavvik, men den kan – som CGH generelt – ikke avsløre balanserte kromosomforandringer, siden den kun registrerer hvor mye DNA som er til stede i hver region.

MLPA – Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

MLPA er en metode som brukes for å måle kopitallsendringer i helt bestemte deler av genomet, og den er svært presis. Den er særlig nyttig når man vil oppdage delesjoner og duplikasjoner som er for små til å ses på en karyotype, men samtidig for målrettede eller vanskelige til at PCR eller sekvensering alltid gir et klart svar.

Metoden baserer seg på et sett prober som er designet til å binde akkurat der man ønsker å undersøke. Hver probe består av to halvdeler som binder på hver sin side av målområdet. Hvis begge halvdelene treffer riktig plass, kan de limes sammen (ligeres) og lage en komplett probe. Bare disse fullt ligerte probene kan kopieres i neste trinn.
Hvis målområdet mangler, for eksempel ved en delesjon, vil ikke halvdelene møte hverandre, og ingen ligering skjer. Da blir det heller ikke noe signal.

Etter ligeringen kopieres alle probene i én felles PCR-reaksjon. Hver probe har sin egen karakteristiske lengde, slik at man senere kan skille PCR-produktene fra hverandre i en kapillærelektroforese. Mengden signal fra hver probe gjenspeiler hvor mange kopier av målområdet som finnes.
Når man ser på resultatet, får man en graf med topper som viser hvor mye signal hver probe gir.
Hos en frisk person blir toppen akkurat så høy som den skal være.
Hvis personen mangler én kopi av et område (heterozygot delesjon), blir toppen omtrent halvparten så høy.
Hvis personen har en ekstra kopi (duplikasjon), blir toppen høyere enn normalt.

MLPA brukes ofte når man undersøker gener der kopitallsendringer er en kjent og viktig sykdomsmekanisme, som ved Duchenne muskeldystrofi, flere kreftgener, og en rekke medfødte syndromer. Metoden er rask, målrettet og svært sensitiv for små delesjoner og duplikasjoner som ligger under deteksjonsgrensen for både karyotyper og array-CGH. Begrensningen er at MLPA bare kan undersøke de områdene det finnes prober for; den kan ikke finne nye eller uventede forandringer utenfor disse regionene.

DNA-isolering

DNA-isolering er det første steget i de fleste molekylærgenetiske analyser. Hensikten er ganske enkel: man skal få tak i rent og intakt DNA som kan brukes videre i PCR, sekvensering, MLPA og andre metoder. For å få til dette må DNA først frigjøres fra cellene, deretter renses, og til slutt samles i en stabil løsning.

I kliniske prøver er blod en vanlig kilde. Etter sentrifugering henter man ut buffy coat – laget hvor de hvite blodcellene ligger – fordi det er disse cellene som inneholder mest DNA. Første trinn er cellysering, der man bruker kjemikalier som løser opp cellemembranene og frigjør DNA-et. Det er litt som å åpne cellene og slippe innholdet ut i løsningen.

Når DNA-et er ute, ligger det fortsatt blandet med proteiner, fettstoffer og andre restmaterialer. For å skille det ut bruker man ofte silica-partikler. I et miljø med høyt salt binder DNA seg lett til overflaten av disse partiklene. Ved hjelp av en magnet kan man så holde partiklene på plass mens resten av løsningen helles av. Etter dette vaskes partiklene grundig for å bli kvitt alt som ikke skal være med videre.

Til slutt må DNA-et løsnes fra silica-partiklene igjen. Det gjøres med en løsning med lavt saltinnhold, som bryter bindingen mellom DNA og silica. DNA-et havner da i en liten mengde ren væske – et eluat – som er klart til bruk.

God DNA-isolering er helt avgjørende. Hvis DNA-et er skadet, forurenset eller dårlig renset, kan det føre til alt fra svake signaler til direkte feil i analysene. Derfor er dette trinnet nøye standardisert i kliniske laboratorier, og kvaliteten kontrolleres grundig før man går videre.

Sammenligning av metoder

Molekylærgenetiske metoder utfyller hverandre fordi de er laget for å oppdage forskjellige typer genetiske forandringer. Ingen metode kan se alt, og derfor må man velge teknikk ut fra hva man faktisk mistenker i en prøve. Noen metoder er veldig presise og ser etter små endringer i enkeltbaser, mens andre gir et overblikk over større deler av genomet. Å vite hva hver metode kan – og ikke kan – er helt nødvendig både i klinikken og i laboratoriet.

PCR og qPCR brukes når man har et veldig spesifikt målområde man vil undersøke. PCR svarer på finnes denne sekvensen eller ikke? mens qPCR også kan måle hvor mye av den som er til stede. Begge metodene er raske og presise, men de ser bare på små områder man allerede kjenner til, og de kan ikke oppdage ukjente eller større forandringer.

Sanger-sekvensering gir den nøyaktige baserekkefølgen i et lite DNA-fragment og er derfor en god metode for å bekrefte mutasjoner eller undersøke et avgrenset område nøye. Men fordi den bare dekker korte sekvenser, egner den seg ikke til store gener, mange gener samtidig eller bred diagnostikk.

NGS gir mye større dekning. Avhengig av hvilken variant man bruker, kan man analysere mange gener på én gang, hele eksomet eller til og med hele genomet. NGS kan oppdage punktmutasjoner, små innsettinger eller tap av baser, og også flere typer større strukturelle forandringer. Paneler har høy presisjon i utvalgte gener, mens eksom- og genomsekvensering gir et langt bredere bilde.
Likevel har også NGS begrensninger, særlig i svært repeterte områder og ved helt store strukturelle avvik.

Karyotyper gir et overblikk over hele kromosomsettet. De er nyttige når man mistenker store avvik som aneuploidier, store delesjoner, translokasjoner eller andre grove strukturelle endringer. Til gjengjeld ser de ikke detaljer så små delesjoner, duplikasjoner og enkeltbaseendringer faller helt utenfor oppløsningen.

FISH brukes når man vil undersøke et helt bestemt kromosomområde. Metoden viser om området er til stede, mangler eller har flyttet seg, men bare der proben faktisk binder. Man får ingen informasjon om resten av genomet.

CGH og array-CGH måler hvor mye DNA som finnes i forskjellige kromosomområder. De er svært gode til å oppdage tap og duplikasjoner, inkludert mikrodeletasjoner. Men fordi de bare ser på mengde, oppdager de ikke balanserte omorganiseringer (som translokasjoner og inversjoner) og heller ikke punktmutasjoner.

MLPA er en målrettet og veldig presis metode for å finne små delesjoner og duplikasjoner i bestemte gener. Den er rask og følsom, men den ser kun på de områdene man har prober for, og gir ingen informasjon om sekvens eller strukturelle endringer utenfor disse områdene.

Metode	Hva den finner	Bruksområde
PCR	En kjent sekvens eller mutasjon	Målrettet mutasjonsanalyse, infeksjoner
qPCR	Mengden av en kjent sekvens	Virusmengde, genekspresjon
RT-PCR	RNA (omdannet til cDNA)	RNA-virus, genekspresjon
Sanger	Punktmutasjoner i små områder	Bekreftelse av mutasjoner
NGS	Mange gener samtidig, små mutasjoner	Arvelige sykdommer, brede paneler
Karyotype	Store kromosomfeil	Trisomier, store strukturelle avvik
FISH	Et bestemt kromosomområde	Translokasjoner, genamplifikasjoner
Array-CGH	Små og store kopitallsendringer	Mikrodele­sjoner/duplikasjoner
MLPA	Kopitallsendringer i ett spesifikt gen	Små delesjoner/duplikasjoner